Name: assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons at JoVE.com

פרוטוקול זה פותח במעבדות של ג&#39;יין דוד, תומאס Jessell ואנדרו לומסדן. אנשים רבים, כולל קונרד Basler, אן Calof, תומאס Edlund, פיל המילטון, Domna Karagogeos, אריאל רואיז אני Altaba ו Toshiya יאמאדה נקבע כיצד explants תרבות של חוט השדרה של קולגן. מרישה Placzek ומארק טסייה-לאבין חלוץ בטכניקה של צמיחה באמצעות האקסון מ ב explants במבחנה כאמצעי זיהוי מולקולות הנחיה האקסון. עבודה במעבדה באטלר נתמך על ידי תרומות של מצעד הפרוטות ו R01 NS063999 מ-NIH / NINDS.

חלק 1: הכנת מצרפי של תאים transfected COS באמצעות טיפות תליה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים COS-7 (COS) תאים בצלחות תרבות 35mm. כאשר הם מגיעים 80% confluency, 1μg transfect הביטוי הפלסמיד לתוך התאים באמצעות Lipofectamine2000 לפי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כד?...

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of the rat spinal cord. , (1984).</li><li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recombinations+in+collagen+gels.">Tissue recombinations in collagen gels.</a> Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).</li><li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li><li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons.">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li><li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons.">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li><li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions.">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li></ol>

גורמים קריטיים הקובעים הצלחה בביצוע הזה assay הם הראשון, רקמות לא צריכים להיות מטופלים עם dispase לתקופה ממושכת מדי, טיפול כזה יביא הרקמה להיות דביק מאוד לאחר ירידה הכדאיות. שני, קולגן חייב להיות דרוך לחלוטין ושמר על הקרח כמה שיותר. זה יהיה קשה יותר ויותר להתמודד אם זה מתחיל...

assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons

אקסונים commissural הגבי בעמוד השדרה חוליות 1 כבר מערכת מודל יסולא בפז שבו כדי לזהות אותות הדרכה האקסון. כאן אנו מתארים ב assay חוץ גופית, &quot;assay ארגון מחדש&quot;, כי כבר נעשה שימוש נרחב כדי לחקור את ההשפעה של אותות החיצונית והרמה הפנימית על האוריינטציה של אקסונים commissural 2. Assay זו פותחה על ידי אנשים רבים במעבדות של ג&#39;יין דוד, תומאס Jessell ואנדרו לומסדן (ראה התודות לפרטים נוספים) וגירסאות של assay זה שימשו כדי להדגים את פעולות ארגון מחדש של מולקולות הנחיה מפתח האקסון, כולל BMP chemorepellent ב הגג צלחת 3,4 ופעילות chemoattractive של Netrin1 5 ו סוניק הקיפוד (ששש) 6 בצלחת הרצפה בחוט השדרה. Explants הכולל 2-3 שכבות הגבי שני שלישים של עמוד השדרה הם גזור מיום עובריים (E) 11 חולדות תרבותי בשלוש ג&#39;ל קולגן ממדי 7. Explants E11 השדרה הגבי מכילים נוירונים commissural שזה עתה נולד, אשר ניתן לזהות על ידי ביטוי axonal שלהם גליקופרוטאין, Tag1 8. במהלך 30-40 שעות בתרבות, מסלול האקסון commissural הוא סיכם אלה explants הגב עם כמובן זמן דומה לזה ראיתי in vivo. מסלול זה axonal ניתן לערער על ידי הצבת או רקמות מבחן או במצטבר תא COS להביע מולקולה מועמד איתות במגע עם אחד הקצוות לרוחב של explant הגבי. אקסונים Commissural הארכת באזור של רקמת צירף יגדל תחת השפעת הצלחת שני גג אנדוגני אותות מן הרקמה לרוחב חוץ רחמי. המידה שבה הם אקסונים commissural ההתמצאות בנסיבות אלו ניתן לכמת. שימוש assay זה, אפשר גם לבחון את ההסתפקות של אות מסוים לארגון מחדש של אקסונים commissural 3,4 כמו גם הצורך לאות זה לכוון את מסלול commissural 9.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons at JoVE.com

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Assay זה מעריך את היכולת של מולקולות איתות, עצם פה חלבון המוךפו&quot;גנטי שהולך 7 (BMP7), לארגון מחדש של אקסונים commissural. Explant של חוט השדרה הגבי העובריים בתרבית הסמוכים המצרפי של הפרשת התאים COS הצמיחה גורמים מועמד. אקסונים commissural ההתמצאות גדל בתוך explant הם דמיינו ידי אימונוהיסטוכימיה.

Assaying את היכולת של מולקולות איתות Diffusible כדי כיוון מחדש עובריים האקסונים Commissural השדרה

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Spinal Cord Electrophysiology

חוט השדרה Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...