Name: assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons at JoVE.com

Questo protocollo è stato sviluppato nei laboratori di Jane Dodd, Thomas Jessell e Andrew Lumsden. Molte persone, tra cui Konrad Basler, Ann Calof, Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba e Toshiya Yamada determinato come espianti cultura del midollo spinale nel collagene. Marysia Placzek e Marc Tessier-Lavigne sperimentato la tecnica di usare la crescita degli assoni da espianti in vitro come mezzo per identificare molecole di guida degli assoni. Lavoro in laboratorio Butler è sostenuto da finanziamenti della March of Dimes e R01 NS063999 dal NIH / NINDS.

Parte 1: Preparazione di aggregati di cellule COS transfettati con gocce <ol><li> COS-7 di semi (COS), le cellule in capsule di Petri da 35 mm. Quando raggiungono l&#39;80% confluenza, 1μg trasfezione del plasmide di espressione nelle cellule utilizzando Lipofectamine2000 secondo il protocollo del produttore s. </li><li> Per preparare appeso gocce, aspirare il terreno di trasfezione e risciacquare le cellule COS transfettate con 1 ml di soluzione tamponata 1x fosfato (PBS). Il trattamento di cellule con 0,5 ml di med...

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of the rat spinal cord. , (1984).</li><li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recombinations+in+collagen+gels.">Tissue recombinations in collagen gels.</a> Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).</li><li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li><li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons.">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li><li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons.">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li><li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions.">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li></ol>

I fattori critici che determinano il successo nello svolgimento di questo saggio sono prima, il tessuto non devono essere trattati con dispasi per un periodo troppo prolungato, tale trattamento sarà seguito nel tessuto diventando molto appiccicosa e con ridotta capacità di sopravvivenza. Due, il collagene deve essere perfettamente innescato e tenuta in ghiaccio il più possibile. Diventerà sempre più difficile da gestire se inizia a impostare, ad esempio si tingono di rosa. Tre, l&#39;ago di tungsteno deve essere se...

assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons

Dorsale commissurali assoni nel midollo spinale dei vertebrati 1 sono stati di un sistema prezioso modello in cui identificare i segnali di guida degli assoni. Qui, descriviamo un test in vitro &quot;, il saggio riorientamento&quot;, che è stato ampiamente utilizzato per studiare l&#39;effetto dei segnali estrinseci ed intrinseci sull&#39;orientamento degli assoni commissurali 2. Questo test è stato sviluppato da numerose persone nei laboratori di Jane Dodd, Thomas Jessell e Andrew Lumsden (si vedano i ringraziamenti per maggiori dettagli) e le versioni di questo test sono stati utilizzati per dimostrare l&#39;attività di riorientamento delle molecole chiave di guida degli assoni, tra cui il chemorepellent in BMP tetto piatto 3,4 e le attività di chemoattractive Netrin1 5 e Sonic hedgehog (Shh) 6 in la lastra di fondo nel midollo spinale. Espianti composto da 2-3 segmenti della dorsale due terzi del midollo spinale vengono sezionati fin dal primo giorno embrionale (E) 11 ratti e coltivate in tre gel collagene dimensionale 7. E11 espianti dorsale spinale contengono neonata commissurali neuroni, che possono essere identificati dal loro espressione della glicoproteina assonale, Tag1 8. Nel corso di 30-40 ore nella cultura, la traiettoria assone commissurali è riassunta in queste espianti dorsale con un decorso simile a quello visto in vivo. Questa traiettoria assonale può essere contestata o posizionando i tessuti di prova o un aggregato di cellule COS esprimono una molecola di segnalazione candidato in contatto con uno dei bordi laterali del espianto dorsale. Assoni commissurali si estende in prossimità del tessuto aggiunto crescerà sotto l&#39;influenza sia della lamiera del tetto endogeno e segnali del tessuto ectopico laterale. Il grado con cui sono riorientato assoni commissurali in queste circostanze può essere quantificato. Da questo test, è possibile sia per esaminare la sufficienza di un segnale particolare di riorientare gli assoni commissurali 3,4 come pure la necessità di questo segnale per dirigere la traiettoria commissurali 9.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons at JoVE.com

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Questo test valuta la capacità di una molecola di segnalazione, qui proteina morfogenetica dell&#39;osso 7 (BMP7), di riorientare gli assoni commissurali. Un espianto di midollo embrionale dorsale spinale è colta adiacente a un aggregato di cellule secernenti COS i fattori di crescita candidato. Riorientato assoni commissurali crescita all&#39;interno del espianto sono visualizzati mediante immunoistochimica.

Capacità di analizzare il diffusibili molecole di segnalazione per l&#39;orientamento embrionali assoni spinali commissurali

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

Fabbricazione di un dispositivo a microfluidi per la compartimentazione dei Neuron Soma e assoni

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Ricerca

Biologia

Spinal Cord Electrophysiology

Spinal Cord Elettrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-mediata rimozione genetica di molecole di segnalazione in fibroblasti di topo coltivate primarie embrionali

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotodecolorazione saggi (FRAP e FLIP) per misurare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in Living cellule staminali embrionali

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Saggiare l&#39;attività chinasi di LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Un sistema per<em&gt; Ex vivo</emColtura&gt; del pancreas embrionale

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Espianti blastomero al test per l&#39;Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

La stimolazione meccanica indotta calcio Wave Propagation in monostrati cellulari: l&#39;esempio di bovini cellule endoteliali corneali

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Mappatura Genome-wide di Drug-DNA interazioni nelle celle con COSMIC (reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...