Name: assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00
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このプロトコルは、ジェーンドッド、トーマスJessellとアンドリューラムズデンの研究室で開発されました。コンラートバスラー、アンCalof、トーマスエドランド、フィルハミルトン、Domna Karagogeos、アリエルルイス私Altabaと俊哉山田を含む多くの人々は、どのようにコラーゲンの脊髄の文化の外植片に決定。 Marysia Placzekとマルクテッシェ-ラヴィーンは、軸索ガイダンスの分子を識別する手段として、生体外植片からで軸索の成長を使用してのテクニックを開拓してきました。バトラーの実験室での作業は、NIH / NINDSからダイムの月とR01 NS063999からの補助金によってサポートされています。

パート1：ハンギングドロップを使用してトランスフェクトしたCOS細胞の集合体の調製<ol><li>種子のCOS - 7（COS）35ミリメートル培養皿中の細胞。彼らは、製造業者のプロトコルに従ってLipofectamine2000を用いて細胞に発現プラスミドの80％コンフルエント、トランスフェ1μgのに到達したとき。 </li><li>吊り滴を準備するには、トランスフェクション培地を吸引し、1Xリン酸緩衝溶液（PBS）を1mlでト...

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	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of the rat spinal cord. , (1984).</li><li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recombinations+in+collagen+gels.">Tissue recombinations in collagen gels.</a> Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).</li><li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li><li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons.">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li><li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons.">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li><li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions.">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li></ol>

このアッセイを行うに成功したかどうかを判断する重要な要因が最初に、組織があまりにも長時間ディスパーゼで処理されるべきではないされ、そのような治療は、組織が非常に粘着性と生存率の減少となることになります。二、コラーゲンは完全にプライムし、可能な限り氷上で保存する必要があります。それが設定を開始する場合は、処理することはますます困難になる、ピンクターン?...

assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons

脊椎動物の脊髄1の背側交連軸索は軸索ガイダンスシグナルを識別するための貴重なモデルシステムとなっている。ここで、我々は、in vitroアッセイ、交連軸索の方向2に外因性と内因性シグナルの効果を研究するために広く用いられている&quot;方向転換アッセイ&quot;、 で説明します。このアッセイは、ジェーンドッド、トーマスJessellとアンドリューラムズデンの研究室で多数の人々によって開発されました（詳細については、確認応答を参照）、このアッセイのバージョンがでchemorepellent BMPを含む、主要な軸索ガイダンス分子の再配向の活動を示すために使用された屋根板3,4と脊髄での床の板でNetrin1 5とソニックヘッジホッグ（Shh）6 chemoattractive活動。 脊髄の背側三分の二の2-3のセグメントを構成する外植片は、胎生（E）11ラットから切除し、三次元コラーゲンゲル7で培養される。 E11背側脊髄外植片は、糖タンパク質、Tag1に8の彼らの軸索の表現によって識別することができる新たに生まれた交連ニューロンが含まれています。文化30〜40時間かけて、交連軸索の軌跡は、 生体内で見られるのと同様のタイムコースでこれらの背側外植片にrecapitulatedている。この軸索軌道は、テストの組織または背側外植片の側縁の一つと接触して候補シグナル伝達分子を発現するCOS細胞の集合のどちらかを置くことによって挑戦することができます。追加された組織の近傍に延在する交連軸索は、内因性の屋根板と異所性の側面組織からの信号の両方の影響を受けて成長します。交連軸索は、これらの状況下でreorientedされる程度を定量化することができる。このアッセイを使用して、それは両方が交連軸索3,4と同様交連軌道9を指示するためにこの信号のための必要性を新しい方向に向けるために特定の信号の十分性を調べることが可能です。

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Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

このアッセイは、交連軸索の向きを変更、シグナル伝達分子、ここに骨形成タンパク質7（BMP7）の能力を評価する。胚の背側脊髄の外植片は、COS細胞の分泌候補増殖因子の集合体に隣接して培養する。外植片の中で成長しているReoriented交連軸索は、免疫組織化学により可視化。

胚脊髄交連軸索アンテナの向きに拡散性のシグナル伝達分子の能力を検定する

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

ニューロン相馬と軸索のコンパートメントのためのマイクロ流体デバイスの作製

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Spinal Cord Electrophysiology

脊髄電気生理学

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

培養一次マウス胚線維芽細胞におけるシグナル伝達分子のアデノウイルス媒介遺伝子除去

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

LRRK2のキナーゼ活性を測定する in vitroで</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

胚発生時に細胞運命のコミットメントをテストするために割球植

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

COSMICと細胞の薬剤-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング（小分子の架橋は、クロマチンを分離するために）

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...