Name: assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00
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이 프로토콜은 제인 다드, 토마스 Jessell와 앤드류 럼즈던의 연구소에서 개발되었다. 방법은 콜라겐의 척수의 문화 explants에 콘레드 바슬러, 앤 Calof, 토마스 에들런드, 필 해밀턴, Domna Karagogeos, 아리엘 루이즈 I Altaba 및 Toshiya 야마다 등 많은 사람들이 결정. Marysia Placzek과 마크 테시어 - 라빈은 축삭지도 분자를 식별하는 수단으로 체외의 explants에서에서 축삭 성장을 사용할 수있는 기술을 개척. 버틀러 실험실에서 작품은 NIH / NINDS에서 천과 R01 NS063999의 3 월부터 기금에 의해 지원됩니다.

1 부 : Transfected COS 세포 집계의 준비 공중 방울을 사용하여 <ol><li> 종자 COS - 7 (COS) 35mm 문화 요리 세포. 그들이 제조 업체의 프로토콜에 따라 Lipofectamine2000을 사용하여 세포에 플라스미드 표현의 80 % confluency, transfect 1μg에 도달했을 때. </li><li> 방울 매달려 준비하려면, transfection 미디어를 기음과 1ml 1X의 인산 버퍼 솔루션 (PBS)로 transfected COS 세포를 헹굴. 15 분 동안 효소가없는 세포 분리 매체의 0.5m...

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	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of the rat spinal cord. , (1984).</li><li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recombinations+in+collagen+gels.">Tissue recombinations in collagen gels.</a> Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).</li><li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li><li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons.">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li><li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons.">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li><li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions.">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li></ol>

이 분석을 수행하는 성공을 결정하는 중요한 요인이 처음이고, 조직이 너무 연장 기간 동안 dispase로 치료해서는 안됩니다, 이러한 치료는 조직이 매우 끈적되고 및 생존 감소가 발생하게됩니다. 둘째, 콜라겐은 완벽하게 준비하는과 최대한 얼음에 보관해야합니다. 이 설정 시작하면 그것은 처리하기 위해 점점 더 어려워 될 것입니다, 핑크 차례 즉. 세는 텅스텐 바늘은 항상 매우 날카로운 보관해...

assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons

척추 척수 1 도설 commissural axons은 축삭지도 신호를 식별하는 귀중한 모델 시스템을왔다. 여기, 우리는 시험 관내 분석, commissural axons의 방향 2 외부와 내장 신호의 효과를 연구하기 위해 광범위하게 사용되고 있습니다 &quot;reorientation 분석&quot;에 대해 설명합니다. 에 chemorepellent BMP를 포함하여,이 분석은 제인 다드, 토마스 Jessell와 앤드류 럼즈던의 실험실에서 수많은 사람들에 의해 개발되었습니다 (자세한 내용은 응답을 참조)이 분석의 버전은 주요 축삭지도 분자의 reorientation 활동을 증명하는 데 사용되었다 지붕 판 3,4 및 Netrin1 5 소닉 헤지 호그 (쉬) 척수의 바닥 판에 6 chemoattractive 활동. 척수의 지느러미 3 분의 2로부터 2-3 세그먼트로 구성된 Explants은 배아 일 (E) 11 쥐에서 해부하고 입체 콜라겐 젤 7 양식입니다. E11 등의 척추 explants은 당단백질, Tag1 8 그들 axonal 표현식에서 확인할 수 있습니다 새로 태어난 commissural 뉴런을 포함합니다. 문화 30-40시간 과정 동안 commissural 축삭의 궤도는 생체내에서 볼 비슷한 시간 코스 이들 지느러미 explants에 recapitulated 있습니다. 이 axonal 탄도는 테스트 조직이나 지느러미 explant의 측면 가장자리 중 하나를 접촉 후보 신호 분자를 표현 COS 셀 집합 중 하나를 배치하여 도전을 수 있습니다. 추가 조직의 주변에 연장 Commissural axons은 내생 지붕 판과 이소성 조직 측면에서 모두 신호의 영향 아래에서 성장합니다. commissural axons 이러한 상황에서 reoriented 아르 정도는 계량하실 수 있습니다. 이 분석을 사용하여 그것은 모두 commissural 궤도 9 직접이 신호의 필요성뿐만 아니라 commissural axons에게 3,4를 방향에 특정 신호의 자족을 확인 할 수 있습니다.

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Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

이 분석은 commissural axons를 방향에 대한 신호 분자의 능력, 여기에 본 Morphogenetic의 단백질 7 (BMP7)을 평가합니다. 배아 등의 척수의 explant는 COS 세포의 secreting 후보 성장 요인의 집계에 인접한 양식입니다. explant 내에서 성장 Reoriented commissural axons은 immunohistochemistry에 의해 시각입니다.

배아 척수 Commissural Axons을 방향을 Diffusible 신호 분자의 능력을 시금

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

신경 소마와 Axons의 Compartmentalization위한 Microfluidic 장치의 제작

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

연구

생물학

Spinal Cord Electrophysiology

척수 전기 생리학

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

교양 차 마우스 배아 섬유아 세포의 신호 분자의 아데노 바이러스 - 매개 유전자 제거

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

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배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

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LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

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위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

세포 단일 층의 기계적 자극에 의​​한 칼슘 웨이브 전파 : 소 각막 내피 세포의 예

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

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COSMIC와 세포의 약물-DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (작은 분자의 가교는 염색질을 분리)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...