Name: assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00
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Este protocolo foi desenvolvido nos laboratórios da Jane Dodd, Thomas Jessell e Lumsden Andrew. Muitas pessoas, incluindo Konrad Basler, Calof Ann, Edlund Thomas, Hamilton Phil, Karagogeos Domna, Ruiz Ariel i Altaba e Yamada Toshiya determinada como explantes cultura da medula espinhal em colágeno. Marysia Placzek e Marc Tessier-Lavigne foi pioneiro na técnica de utilização de crescimento do axônio em explantes in vitro como forma de identificar moléculas de orientação axônio. Trabalho no laboratório Butler é suportado por concessões do March of Dimes e R01 NS063999 de NIH / NINDS.

Parte 1: Preparação de agregados de células COS Transfectados usando gotas de suspensão <ol><li> COS-7 sementes (COS), as células em placas de cultura de 35 mm. Quando chegar a 80% confluência, 1μg transfecção do plasmídeo de expressão para as células usando Lipofectamine2000 acordo com o protocolo do fabricante s. </li><li> Para preparar pendurado gotas, aspire o meio de transfecção e lavar as células transfectadas COS com 1ml de 1x Phosphate Buffered Solution (PBS). Tratar células com 0,5 ml de enzim...

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	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of the rat spinal cord. , (1984).</li><li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recombinations+in+collagen+gels.">Tissue recombinations in collagen gels.</a> Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).</li><li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li><li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons.">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li><li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons.">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li><li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions.">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li></ol>

Os fatores críticos que determinam o sucesso na realização deste ensaio são, primeiro, o tecido não devem ser tratados com dispase por muito prolongado período, este tratamento irá resultar no tecido tornando-se muito pegajoso e ter uma redução da viabilidade. Dois, o colágeno devem estar perfeitamente preparados e mantidos em gelo, tanto quanto possível. Vai tornar-se cada vez mais difícil lidar com se começa a definir, ou seja, passam a rosa. Três, a agulha de tungstênio devem ser mantidos sempre muito ...

assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons

Dorsal axônios comissurais na medula espinhal dos vertebrados 1 ter sido um modelo de sistema de valor inestimável em que identificar sinais de orientação axônio. Aqui, descrevemos um ensaio in vitro &quot;, a reorientação do ensaio&quot;, que tem sido amplamente utilizado para estudar o efeito dos sinais extrínsecos e intrínsecos na orientação dos axônios comissurais 2. Este ensaio foi desenvolvido por várias pessoas nos laboratórios da Jane Dodd, Thomas Jessell e Lumsden Andrew (ver agradecimentos para mais detalhes) e versões deste ensaio foram usadas para demonstrar as atividades reorientação de orientação das moléculas-chave axônio, incluindo o BMP chemorepellent na chapa de teto 3,4 e as atividades de quimioatratante Netrin1 5 e Sonic hedgehog (Shh) 6 na placa de fundo na medula espinhal. Explantes compreendendo 2-3 segmentos da dorsal de dois terços da medula espinhal são dissecados a partir de dia embrionário (E) 11 ratos e cultivadas em três géis de colágeno dimensional 7. E11 dorsal explantes espinhal contém recém-nascido neurônios comissurais, que podem ser identificadas pela sua expressão axonal da glicoproteína, Tag1 8. Ao longo de 30-40 horas em cultura, a trajetória dos axônios comissurais está resumida nestas explantes dorsal com um curso de tempo similar ao observado in vivo. Essa trajetória axonal pode ser contestada, colocando tecidos ou de teste ou um agregado de células COS expressando uma molécula de sinalização candidato em contato com uma das bordas laterais do explante dorsal. Axônios comissurais estendendo na vizinhança do tecido anexado vai crescer sob a influência de ambas as placas do telhado do endógenos e sinais do tecido ectópico lateral. O grau em que os axônios comissurais são reorientadas sob essas circunstâncias podem ser quantificados. Com este ensaio, é possível tanto para examinar a suficiência de um sinal especial para reorientar axônios comissurais 3,4, assim a necessidade de este sinal para direcionar a trajetória comissural 9.

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Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Este ensaio avalia a capacidade de uma molécula de sinalização, aqui proteína morfogenética óssea 7 (BMP7), para reorientar axônios comissurais. Um explante da medula espinhal dorsal embrionárias cultivadas é adjacente a um agregado de células secretoras de COS os fatores de crescimento candidato. Reorientou axônios comissurais crescendo dentro do explante são visualizados através da imuno-histoquímica.

Doseamento do Capacidade de difusíveis moléculas sinalizadoras para Reorientar embrionárias Spinal Axônios comissural

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

Fabricação de um dispositivo micro para a compartimentação de Neuron Soma e axônios

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Biologia

Spinal Cord Electrophysiology

Spinal Cord Eletrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovírus mediada por remoção genética das moléculas de sinalização em fibroblastos de rato cultivadas Primária embrionárias

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotobranqueamento Ensaios (FRAP &amp; FLIP) a Medida Dynamics Protein Chromatin em Viver Células-Tronco Embrionárias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Doseamento do atividade da quinase de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Mapeamento de todo o genoma de DNA Interações medicamentosas-em células com COSMIC (reticulação de moléculas pequenas para isolar Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...