Name: assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons at JoVE.com

Этот протокол был разработан в лабораториях Джейн Додд, Томас Jessell и Эндрю Ламсден. Многие люди, в том числе Конрад Basler, Энн Calof, Томас Эдлунд, Фил Гамильтон, Домна Karagogeos, Ариэль Руис я Altaba и Toshiya Ямада определяется как культура эксплантов спинного мозга в коллагене. Марыся Плачека и Марк Тессье-Лавинь впервые методика использования аксон рост в пробирке из эксплантов в качестве средства идентификации молекул аксон руководства. Работа в Батлер лаборатории поддержана грантами марте Dimes и R01 NS063999 из NIH / NINDS.

Часть 1: Подготовка агрегатов трансфицированных клеток COS использованием висячие капли <ol><li> Семенной COS-7 (COS) клеток в 35 блюдах культуры. Когда они достигают 80% слияния, трансфекции 1 мкг выражения плазмиды в клетки с помощью Lipofectamine2000 в соответствии с протоколом производителя с. </li><li> Дл...

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of the rat spinal cord. , (1984).</li><li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recombinations+in+collagen+gels.">Tissue recombinations in collagen gels.</a> Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).</li><li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li><li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons.">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li><li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons.">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li><li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions.">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li></ol>

Критические факторы, которые определяют успех в выполнении этого теста во-первых, ткань не следует относиться с dispase слишком длительного периода, такое лечение может привести к ткань становится очень липким и снизившись жизнеспособность. Два, коллагена должны быть идеально загрунтова...

assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons

Спинной спаечный аксонов в спинном мозге позвоночных 1 были неоценимую системы модель, в которой для выявления сигналов аксонов руководства. Здесь мы описываем в пробирке анализ &quot;, переориентация анализа&quot;, который широко используется для изучения влияния внешних и внутренних сигналов от ориентации спаечный аксонов 2. Этот анализ был разработан многочисленный народ в лабораториях Джейн Додд, Томас Jessell и Эндрю Ламсден (см. благодарность за более подробной информацией) и версии данного анализа были использованы для демонстрации переориентации деятельности ключевых молекул, руководство аксонов, в том числе БМП chemorepellent в потолочной панелью 3,4 и chemoattractive деятельности Netrin1 5 и Еж Соник (SHH) 6 в пол пластины в спинном мозге. Эксплантов включающий 2-3 сегментов спинного две трети спинного мозга расчлененное из эмбриональных день (E) 11 крыс и культивировали в трехмерном гели коллагена 7. E11 спинной спинного эксплантов содержать новорожденного спаечный нейронов, которые могут быть идентифицированы по их аксонального выражение гликопротеин, Tag1 8. В течение 30-40 часов в культуре, спаечный траектории аксона воспроизводятся в этих спинной эксплантов со временем конечно же, увидеть в естественных условиях. Это аксонального траектория может быть обжаловано путем размещения либо тест ткани или совокупности COS ячейки выражения кандидата сигнальной молекулы в контакте с одной из боковых краев спинной эксплантов. Спаечный аксонов расширения в непосредственной близости от добавляется ткань будет расти под влиянием как эндогенных пластины крыши и сигналы от внематочной боковой ткани. Степень, в которой спаечный аксоны переориентированы в этих условиях могут быть определены количественно. С помощью этого теста, можно и рассмотреть достаточность определенный сигнал для переориентации спаечный аксонов 3,4, а также необходимость для этого сигнала, чтобы направить спаечный траектории 9.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons at JoVE.com

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Этот тест оценивает способность сигнальной молекулы, здесь костные морфогенетические белки 7 (BMP7), переориентировать спаечный аксонов. Эксплантов эмбриональной спинной спинного мозга выращиваются прилегающих к совокупности COS клетки, секретирующие факторы роста кандидата. Переориентация спаечный аксонов, растущее внутри эксплантатов визуализируются по иммуногистохимии.

Опробование Способность к диффузии сигнальных молекул переориентировать Эмбриональные спинного спаечный Аксоны

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

Изготовление микрожидкостных Устройство для дробления Нейрон Сома и Аксоны

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Spinal Cord Electrophysiology

Спинной мозг электрофизиологии

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Аденовирус-опосредованной Генетические Удаление сигнальных молекул в культуре первичных мышиных эмбриональных фибробластов

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Фотообесцвечивания Анализы (FRAP и FLIP), чтобы измерить хроматина Динамика белков в живых эмбриональных стволовых клеток

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Опробование киназы Деятельность LRRK2 В пробирке</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Система<em&gt; Бывших естественных условиях</em&gt; Культивирования эмбриональных поджелудочной железы

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Бластомеров эксплантов для тестирования для сотовых приверженности судьбы во время эмбрионального развития

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Механическое раздражение индуцированных кальция Распространение волн в монослоев клеток: Пример бычьего эндотелиальных клеток роговицы

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Генома Отображение лекарственно-ДНК взаимодействий в клетках с космическими (сшивание малых молекул изолировать хроматина)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Визуализация пространственной реорганизацией МАРК сигнального пути с помощью переходного процесса система экспрессии Tobacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...