Name: assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00
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Este protocolo fue desarrollado en los laboratorios de Jane Dodd, Jessell Thomas y Andrew Lumsden. Muchas personas, incluyendo Konrad Basler, Calof Ann, Edlund Thomas, Hamilton Phil, Karagogeos Domna, Ariel Ruiz i Altaba y Yamada Toshiya determina la forma de explantes de la cultura de la médula espinal en el colágeno. Marysia Placzek y Marc Tessier-Lavigne fue pionero en la técnica de utilización de crecimiento de los axones de in vitro de explantos, como medio de identificación de las moléculas de orientación axón. El trabajo en el laboratorio de Butler es apoyado por becas de la Fundación March of Dimes y NS063999 R01 de NIH / NINDS.

Parte 1: Preparación de los agregados de células transfectadas COS el uso de gotas colgantes <ol><li> COS-7 semillas (COS), las células en placas de cultivo de 35 mm. Cuando llegan a un 80% 1 g confluencia, transfectar del plásmido de expresión en las células utilizando Lipofectamine2000 según el protocolo del fabricante s. </li><li> Para preparar las gotas colgantes, aspirar el medio de transfección y aclarar las células COS transfectadas con 1 ml de solución tampón fosfato 1x (PBS). Tratar las células co...

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	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of the rat spinal cord. , (1984).</li><li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recombinations+in+collagen+gels.">Tissue recombinations in collagen gels.</a> Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).</li><li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li><li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons.">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li><li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons.">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li><li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions.">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li></ol>

Los factores críticos que determinan el éxito en la realización de este ensayo son en primer lugar, el tejido no debe ser entendido con dispasa demasiado prolongada de un período, este tratamiento se traducirá en el tejido a ser muy pegajoso y con disminución de la viabilidad. Dos, el colágeno debe estar perfectamente preparado y mantenerse en hielo tanto como sea posible. Cada vez será más difícil de manejar si se empieza a configurar, es decir, a su vez de color rosa. Tres, la aguja de tungsteno debe estar s...

assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons

Axones de la comisura dorsal de la médula espinal de vertebrados han sido un modelo de un sistema de valor incalculable en el que para identificar las señales de guía axonal. Aquí se describe un ensayo in vitro &quot;, el ensayo de reorientación&quot;, que se ha utilizado ampliamente para estudiar el efecto de las señales intrínsecas y extrínsecas en la orientación de los axones de la comisura 2. Este ensayo fue desarrollado por numerosas personas en los laboratorios de Jane Dodd, Jessell Thomas y Andrew Lumsden (ver agradecimientos para más detalles) y las versiones de este ensayo se utilizaron para demostrar las actividades de la reorientación de las principales moléculas axón orientación, incluyendo la chemorepellent en el BMP techo de placa de 3,4 y las actividades de chemoattractive Netrin1 5 y Sonic Hedgehog (Shh) 6 en la placa de piso en la médula espinal. Explantes que comprende 2-3 segmentos de la dorsal de dos tercios de la médula espinal se disecan a partir del día embrionario (E) 11 ratas y se cultivaron en tres dimensiones geles de colágeno 7. E11 espinal dorsal explantes contienen recién nacido neuronas comisurales, que pueden ser identificadas por su expresión axonal de la glicoproteína, Tag1 8. En el transcurso de 30-40 horas en la cultura, la trayectoria de los axones comisurales se resume en estas explantes dorsal con un tiempo similar a la observada en vivo. Esta trayectoria axonal puede ser impugnada mediante la colocación de cualquiera de los tejidos de prueba o un agregado de células COS que expresan una molécula de señalización candidato en contacto con uno de los bordes laterales de la explante dorsal. Axones de la comisura que se extienden en los alrededores del tejido adjunta crecerá bajo la influencia de la placa del techo y las señales endógenas de los tejidos laterales ectópico. El grado en que los axones de la comisura se reorientan en estas circunstancias se pueden cuantificar. El uso de este ensayo, es posible tanto a examinar la suficiencia de una señal en particular para reorientar axones de la comisura 3,4 y la necesidad de que esta señal para dirigir la trayectoria de la comisura 9.

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Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Este ensayo evalúa la capacidad de una molécula de señalización, la proteína morfogenética ósea 7 aquí (BMP7), para reorientar axones de la comisura. Un explante de la médula espinal dorsal de embriones se cultivaron junto a un conjunto de células secretoras de COS los factores de crecimiento candidato. Reorientado axones de la comisura de crecimiento en el explante se visualizan mediante técnicas de inmunohistoquímica.

Ensayo de la capacidad de difusible moléculas de señalización para reorientar embrionarias axones de la comisura espinal

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

Fabricación de un dispositivo de microfluidos para la compartimentación de las neuronas y los axones Soma

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Investigación

Biología

Spinal Cord Electrophysiology

La médula espinal de Electrofisiología

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Mediada por adenovirus eliminación de moléculas de señalización genética en cultivos de fibroblastos de embriones de ratón primaria

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching ensayos (FRAP y FLIP) para medir la dinámica de la cromatina de proteínas en células vivas madre embrionarias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Ensayo de la actividad quinasa de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Los explantes blastómeras para la Prueba de Compromiso destino celular durante el desarrollo embrionario

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mecánica estimulación inducida por calcio Propagación de Ondas en monocapas de células: el ejemplo de las especies bovina células endoteliales corneales

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Mapeo de todo el genoma de la droga-ADN interacciones en células con COSMIC (reticulación de pequeñas moléculas para aislar la cromatina)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

La formación de imágenes reorganización espacial de una vía de señalización MAPK Usando el sistema de expresión transitoria del Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...