Name: assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons at JoVE.com

Detta protokoll utvecklades i laboratorier Jane Dodd, Thomas Jessell och Andrew Lumsden. Många människor, däribland Konrad Basler, Ann Calof, Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz jag Altaba och Toshiya Yamada bestäms hur kulturen explants av ryggmärgen i kollagen. Marysia Placzek och Marc Tessier-Lavigne var först med tekniken att med hjälp av axonet tillväxt in vitro explants som ett sätt att identifiera molekyler Axon vägledning. Arbetet i Butler laboratoriet stöds med bidrag från March of Dimes och R01 NS063999 från NIH / NINDS.

Del 1: Förberedelse av aggregat av transfekterade COS celler med hängande Drops <ol><li> Seed COS-7 (COS) celler i 35mm kultur rätter. När de når 80% confluency, transfektera 1μg av uttrycket plasmiden in i cellerna med hjälp av Lipofectamine2000 enligt tillverkarens s protokoll. </li><li> För att förbereda hängande droppar, aspirera transfektion mediet och skölj transfekterade COS celler med 1 ml 1x Fosfatbuffrad Solution (PBS). Behandla celler med 0,5 ml enzym-fri ruta dissociation medium för 15 minuter....

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of the rat spinal cord. , (1984).</li><li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recombinations+in+collagen+gels.">Tissue recombinations in collagen gels.</a> Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).</li><li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li><li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons.">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li><li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons.">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li><li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions.">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li></ol>

De kritiska faktorer som avgör framgång i att utföra denna analys är det första bör vävnaden inte behandlas med dispase under alltför lång en period, kommer en sådan behandling resultera i vävnaden blir mycket trög och har minskat lönsamheten. Två måste kollagen vara helt förberedd och förvaras på is så mycket som möjligt. Det blir allt svårare att hantera om det börjar att ställa in, dvs bli rosa. Tre måste volfram nål alltid hållas mycket skarp.

assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons

Dorsal commissural axoner i ryggradsdjur ryggmärgen 1 har en ovärderlig modellsystem där för att identifiera signaler Axon vägledning. Här beskriver vi en in vitro &quot;, den nya inriktningen assay&quot;, som har används i stor utsträckning för att studera effekten av yttre och inneboende signaler om inriktningen på commissural axoner 2. Denna analys har utvecklats av många personer i laboratorier Jane Dodd, Thomas Jessell och Andrew Lumsden (se erkännanden för mer information) och versioner av denna analys användes för att demonstrera omorientering verksamhet viktiga molekyler Axon vägledning, inklusive BMP chemorepellent i takplåt 3,4 och chemoattractive verksamhet Netrin1 5 och Sonic Hedgehog (Shh) 6 i golvet plattan i ryggmärgen. Explants bestående av 2-3 segment på rygg två tredjedelar av ryggmärgen dissekeras från embryonala dag (E) 11 råttor och odlas i tredimensionell kollagen geler 7. E11 rygg spinal explants innehåller nyfödda commissural nervceller, som kan identifieras genom sina axonal uttryck för glykoprotein, Tag1 8. Under loppet av 30-40 timmar i kulturen, är commissural axonet banan rekapitulerade i dessa dorsal explants med en tid kursen liknar den som ses in vivo. Detta axonal bana kan utmanas genom att antingen testa vävnader eller en COS cell samlade uttrycker en kandidat signalmolekyl i kontakt med en av sidokanter rygg Explantation. Commissural axoner sträcker sig i närheten av den bifogade vävnad kommer att växa under inflytande av både de endogena takplåt och signaler från ektopisk laterala vävnad. I vilken grad commissural axoner är en ny inriktning under dessa omständigheter kan kvantifieras. Med hjälp av denna analys är det möjligt att både undersöka tillräckliga för en viss signal till omorientera commissural axoner 3,4 samt nödvändigheten av denna signal för att styra commissural bana 9.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons at JoVE.com

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Denna analys bedömer förmågan hos en signalmolekyl, här Benmorfogenetiska Protein 7 (BMP7), för att inrikta commissural axoner. En Explantation av embryonala dorsal ryggmärgen är odlade i anslutning till ett sammanlagt COS celler utsöndrar kandidaten tillväxtfaktorer. Omorienterat commissural axoner växer inom Explantation synliga genom immunohistokemi.

Testmetoder förmåga diffusionsväte signalmolekyler för att inrikta Embryonala Spinal commissural Axoner

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

Tillverkning av en mikroflödessystem enhet för uppdelning av Neuron Soma och Axoner

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Spinal Cord Electrophysiology

Ryggmärg Elektrofysiologi

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-medierad genetisk Borttagning av signalmolekyler i odlade primära musknappen Embryonala fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotoblekning tester (FRAP &amp; Flip) för att mäta Chromatin Protein Dynamics i Living embryonala stamceller

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Testmetoder för att kinasaktivitet av LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Ett system för<em&gt; Ex vivo</em&gt; Odling av embryonala Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomer Explantat att testa Cell Fate engagemang under embryonal utveckling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mekanisk stimulering-inducerad Kalcium vågutbredning i cellmonoskikt: exemplet Nötkreatur hornhinnan endotelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genomvid Kartläggning av narkotika DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tvärbindning av små molekyler att isolera Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Avbildning Rumslig Reorganisation av ett MAPK-signalvägen Använda Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...