Name: assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons at JoVE.com

Bu protokol, Jane Dodd, Thomas Jessell ve Andrew Lumsden laboratuvarlarında geliştirildi. Kollajen omurilik kültürü eksplantlar Konrad Basler, Ann Calof Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba ve Toshiya Yamada da dahil olmak üzere birçok kişi belirlendi. Marysia Placzek ve Marc Tessier-Lavigne akson rehberliği moleküllerinin belirlenmesi için bir araç olarak in vitro eksplantlar akson büyüme kullanarak tekniğinin öncülüğünü yaptı. Butler, laboratuvar İş NIH / NINDS Dimes ve R01 NS063999 Mart hibe tarafından desteklenmektedir.

Bölüm 1: transfekte COS Hücreler Agrega hazırlanması Asma Damlalar <ol><li> Tohum COS-7 (COS) 35mm kültür kaplarına hücreler. % 80 üretici s protokole göre Lipofectamine2000 kullanarak hücrelerin içine plazmid ifade confluency, transfect 1μg ulaştığınızda. </li><li> Damla asılı hazırlamak için, transfeksiyon orta aspirat ve transfekte COS hücreleri 1ml 1x Fosfat Tamponlu Çözümü (PBS) ile yıkayın. 0.5 ml, 15 dakika boyunca enzim ücretsiz cep disosiasyon orta hücreleri davranın. 1 ml rea...

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of the rat spinal cord. , (1984).</li><li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recombinations+in+collagen+gels.">Tissue recombinations in collagen gels.</a> Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).</li><li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li><li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons.">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li><li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance.">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons.">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li><li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions.">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li></ol>

Bu testte gerçekleştirme başarısını belirlemek kritik faktörler, doku, çok uzun süre bir süre için dispase ile tedavi edilmesi gerektiğini, bu tedavi çok yapışkan hale doku ve canlılığı azalmış olan yol açacaktır. İki, kollajen mükemmel astar ve mümkün olduğu kadar buz üzerinde muhafaza edilmelidir. Ayarlamaya başlıyor işlemek için giderek daha zor olacak, yani pembe. Üç, tungsten iğne her zaman çok keskin tutulması gerekir.

assaying the ability of diffusible signaling molecules to reorient embryonic spinal commissural axons

Omurgalı omurilik 1 Dorsal commissural aksonlar aksona yol sinyalleri tanımlamak için paha biçilmez bir model sistem var. Burada, in vitro testi commissural aksonlar yönünü 2 dışsal ve içsel sinyalleri etkisini araştırmak için yaygın olarak kullanılan &quot;yeniden yönlendirilmesi assay&quot; açıklar. Bu testte, BMP, chemorepellent dahil olmak üzere, çok sayıda kişi tarafından Jane Dodd, Thomas Jessell ve Andrew Lumsden laboratuarlarında geliştirilen (Daha fazla bilgi için teşekkürler) ve bu testte sürümlerini anahtar akson rehberlik molekülleri yeniden yönlendirilmesi faaliyetleri göstermek için kullanılan 3,4 ve Netrin1 5 ve Sonic Hedgehog (Shh) omurilik zemin plakasını 6 chemoattractive faaliyetleri çatı plakası. Eksplantlarındaki 2-3 segmentlerinde omurilik dorsal üçte ikisini oluşturan embriyonik gün (E) 11 sıçan disseke ve üç boyutlu kolajen jeller 7 olarak kültür. E11 dorsal spinal eksplantlar glikoprotein, tag1 8 aksonal ifade tarafından tespit edilebilir, yeni doğan commissural nöronlar, içerir . Commissural akson yörünge kültür 30-40 saat boyunca, in vivo olarak görülen benzer bir ders ile bu sırt eksplantlar değinmeyecek. Bu aksonal yörünge test dokuları ya da dorsal eksplant lateral kenarlarından biri ile temas aday sinyalleme molekülü ifade eden bir COS hücre agrega ya koyarak itiraz edilebilir. Eklenen doku çevresinde uzanan Commissural aksonlar endojen çatı plaka ve ektopik lateral doku sinyalleri hem de etkisi altında büyüyecek. Bu koşullar altında commissural aksonlar Nokia&#39;nın derecesi belirlenebilir. Bu testte kullanarak, hem de belirli bir sinyal commissural yörünge 9 doğrudan bu sinyal gerekliliği sıra commissural aksonlar 3,4 reorient yeterliliğini incelemek mümkündür.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons at JoVE.com

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Bu testte commissural aksonların yeniden yönlendirmek için bir sinyal molekülü yeteneği, burada kemik morfogenetik protein 7 (BMP7) değerlendirir. Embriyonik dorsal spinal kord bir eksplant COS hücreleri salgılayan aday büyüme faktörleri toplu bir komşu kültür. Eksplant içinde büyüyen Nokia&#39;nın commissural aksonlar immünohistokimya ile görüntülendi.

Embriyonik Spinal Commissural Aksonlar yönünü difüze Sinyal Molekülleri yeteneği Assaying

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

Nöron Soma ve Aksonlar compartmentalization mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Spinal Cord Electrophysiology

Omurilik Elektrofizyoloji

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Kültür İlköğretim Fare Embriyonik Fibroblastlar Sinyal Molekülleri Adenovirüs aracılı Genetik Kaldırma

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...