Name: isolation of labile multi-protein complexes by in vivo controlled cellular cross-linking and immuno-magnetic affinity chromatography
Uploaded: 2010-03-09T17:05:05
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות בארה&quot;ב כדי VF (NS42599 ו GM077569).

1. הכנה Crosslinking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יהיה עליך צלחת מספר מספיק של תאים כדי לאפשר בידוד של 500 מיקרוגרם חלבון לכל תגובה צינור רגיל. צינור אחד עשוי להיות מספיק לזיהוי interactors המשוערת של חלבון של עניין על ידי immunoblot. במקרה זה, החומר חייב חרוז ניתן elu...

<ol>
	<li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermansky-Pudlak+syndrome+protein+complexes+associate+with+phosphatidylinositol+4-kinase+type+II+alpha+in+neuronal+and+non-neuronal+cells.">Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells.</a> J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).</li><li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+of+extended+biological+structures:+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+[35S]dithiobis(succinimidyl+propionate.">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate.</a> J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).</li><li>Xiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+DSP,+a+reversible+cross-linker,+to+fix+tissue+sections+for+immunostaining,+microdissection+and+expression+profiling.">Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling.</a> Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).</li><li>Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4-Kinase+Type+II+Alpha+Contains+an+AP-3+Sorting+Motif+and+a+Kinase+Domain+that+are+both+Required+for+Endosome+Traffic.">Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic.</a> Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).</li><li>Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+and+non-neuronal+functions+of+the+AP-3+sorting+machinery.">Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery.</a> J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).</li><li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zinc+Transporter+ZnT3+interacts+with+AP-3+and+it+is+Targeted+to+a+Distinct+Synaptic+Vesicle+Subpopulation.">The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation.</a> Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes.">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li></ol>

DSP, קרום חדיר, crosslinker לצמצם כימית עם זרוע spacer של 12 משמש לייצוב אינטראקציות חלבון חולף 1,2,3,4. כאן אנו שהודגם אסטרטגיה זו מורכבת מתאם AP-3 מורכב חלבון מסיס שמכירה וממיין חלבונים בממברנה לתוך שלפוחית ​​מ endosomes 5. AP-3 נקשר באופן סלקטיבי טרנספורטר אבץ ZnT3 ואת השומנים ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P4417</td>
<td>Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22585</td>
<td>Moisture sensitive, store in air tight container 4&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D2650</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100, SigmaUltra</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>110.31</td>
<td>Beads are also available as sheep anti-rabbit</td>
</tr>
<tr>
<td>Dyna-Mag-2 magnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>123-21D</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of labile multi-protein complexes by in vivo controlled cellular cross-linking and immuno-magnetic affinity chromatography

האופי הדינמי של machineries הסלולר בנויה לעתים קרובות על עמותות חלבון חולף ו / או חלש. אינטראקציות אלה זיקה נמוכה למנוע שיטות המחמירים עבור בידוד וזיהוי של רשתות חלבון סביב חלבון של עניין. השימוש crosslinkers כימיים מאפשרת ייצוב סלקטיבי של אינטראקציות יציב, ובכך לעקוף את מגבלות ביוכימיות לטיהור. כאן אנו מציגים פרוטוקול מקובל עבור התאים בתרבית המשתמשת crosslinker homobifunctional עם זרוע spacer של 12 א &#39;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP הוא ביקע על ידי הפחתה של קשר disulphide נוכח המולקולה. Cross-linking בשילוב עם כרומטוגרפיה של חלבונים immunoaffinity עניין עם חרוזים מגנטיים מאפשר בידוד של קומפלקסים חלבונים כי אחרת לא יעמוד טיהור. פרוטוקול זה תואם קבוע טכניקות כתם המערבי וזה יכול להיות scaled עד לזיהוי חלבונים על ידי ספקטרומטריית מסה 1. סטפני א Zlatic ופרל V. ריידר תרמו באופן שווה על עבודה זו.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography at JoVE.com

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

התא חדיר crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] מייצב אינטראקציות חלוף יציב<em&gt; In vivo</em&gt;, המאפשרת בידוד מחמירים שלהם באמצעות חלבון מורכב טכניקות לטיהור. כאן אנו מציגים טכניקה תאים crosslinking גדל בתרבות בעקבות הבידוד של קומפלקסים חלבונים על ידי immunoprecipitation.

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides

תמונה-induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) יישומית כדי פפטידים Amyloidogenic

The assembly of amyloidogenic proteins into toxic oligomers is a seminal event in the pathogenesis of protein misfolding diseases, including Alzheimer's, ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

טיטרציה Calorimetry מקורר באופן איזוטרמי עבור מדידת מקרומולקולה-ליגנד זיקה

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...