Name: isolation of labile multi-protein complexes by in vivo controlled cellular cross-linking and immuno-magnetic affinity chromatography
Uploaded: 2010-03-09T17:05:05
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यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य के VF संस्थान (NS42599 और GM077569) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

1. Crosslinking के लिए तैयारी <ol><li> आप थाली करने के लिए कक्षों की एक पर्याप्त संख्या की आवश्यकता के लिए मानक ट्यूब प्रतिक्रिया प्रति प्रोटीन की 500 μg के अलगाव की अनुमति देगा. एक एकल ट्यूब immunoblot द्वारा ब्याज की एक प्रो?...

<ol>
	<li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermansky-Pudlak+syndrome+protein+complexes+associate+with+phosphatidylinositol+4-kinase+type+II+alpha+in+neuronal+and+non-neuronal+cells.">Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells.</a> J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).</li><li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+of+extended+biological+structures:+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+[35S]dithiobis(succinimidyl+propionate.">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate.</a> J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).</li><li>Xiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+DSP,+a+reversible+cross-linker,+to+fix+tissue+sections+for+immunostaining,+microdissection+and+expression+profiling.">Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling.</a> Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).</li><li>Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4-Kinase+Type+II+Alpha+Contains+an+AP-3+Sorting+Motif+and+a+Kinase+Domain+that+are+both+Required+for+Endosome+Traffic.">Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic.</a> Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).</li><li>Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+and+non-neuronal+functions+of+the+AP-3+sorting+machinery.">Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery.</a> J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).</li><li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zinc+Transporter+ZnT3+interacts+with+AP-3+and+it+is+Targeted+to+a+Distinct+Synaptic+Vesicle+Subpopulation.">The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation.</a> Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes.">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li></ol>

डीएसपी, एक झिल्ली पारगम्य, 12 ए की एक स्पेसर भुजा के साथ रासायनिक कम करने योग्य crosslinker क्षणिक प्रोटीन 1,2,3,4 बातचीत को स्थिर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यहाँ हम एडाप्टर एपी 3 परिसर में एक घुलनशील प्रोटी?...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P4417</td>
<td>Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22585</td>
<td>Moisture sensitive, store in air tight container 4&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D2650</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100, SigmaUltra</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>110.31</td>
<td>Beads are also available as sheep anti-rabbit</td>
</tr>
<tr>
<td>Dyna-Mag-2 magnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>123-21D</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of labile multi-protein complexes by in vivo controlled cellular cross-linking and immuno-magnetic affinity chromatography

सेलुलर मशीनरी के गतिशील स्वभाव अक्सर क्षणिक और / या कमजोर प्रोटीन संघों पर बनाया गया है. ये कम आत्मीयता बातचीत अलगाव और ब्याज की एक प्रोटीन के चारों ओर प्रोटीन नेटवर्क की पहचान के लिए कड़े तरीकों रोकता. रासायनिक crosslinkers का उपयोग अस्थिर बातचीत के चुनिंदा स्थिरीकरण की अनुमति देता है, इस प्रकार की शुद्धि के लिए जैव रासायनिक सीमाओं को दरकिनार. यहाँ हम वर्तमान संस्कृति में कोशिकाओं के लिए उत्तरदायी प्रोटोकॉल है कि एक स्पेसर के हाथ के साथ एक homobifunctional crosslinker का उपयोग करता है 12 ए, dithiobis (proprionate succinimidyl) (डीएसपी). डीएसपी Disulphide अणु में मौजूद बांड की कमी से cleaved है. चुंबकीय मोतियों के साथ ब्याज की प्रोटीन का immunoaffinity क्रोमैटोग्राफी साथ संयुक्त क्रॉस को जोड़ने प्रोटीन परिसरों कि अन्यथा शुद्धि नहीं झेलने होगा अलगाव की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल नियमित रूप से पश्चिमी धब्बा तकनीक के साथ संगत है और यह प्रोटीन की पहचान के लिए किया जा सकता मास स्पेक्ट्रोमेट्री 1 के द्वारा बढ़ाया है. स्टेफ़नी ए Zlatic और पर्ल वी. राइडर इस काम के लिए समान रूप से योगदान दिया.

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Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

सेल पारगम्य डीएसपी crosslinker [dithiobis (succinimidyl propionate)] स्थिर क्षणिक और अस्थिर बातचीत<em&gt; Vivo में</em&gt;, जो उनके अलगाव की अनुमति देता कड़े प्रोटीन जटिल शोधन तकनीक का उपयोग. यहाँ हम crosslinking संस्कृति में विकसित कोशिकाओं immunoprecipitation द्वारा प्रोटीन परिसरों के अलगाव के बाद के लिए तकनीक मौजूद है.

अस्थिर मल्टी प्रोटीन परिसर के अलगाव द्वारा Vivo में नियंत्रित पार से जोड़ने और इम्यूनो - चुंबकीय आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी सेलुलर

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides

फोटो प्रेरित पार से जोड़ने असंशोधित प्रोटीन (पीआईसीयूपी) Amyloidogenic पेप्टाइड्स लागू करने के लिए

The assembly of amyloidogenic proteins into toxic oligomers is a seminal event in the pathogenesis of protein misfolding diseases, including Alzheimer's, ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के साथ एस cerevisiae में प्रोटीन परिसरों की पहचान

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

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एकल आण्विक परिसर Visualizing Vivo में उन्नत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

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ELIME Mycotoxin जांच के लिए विधि (एनजाइम इम्यूनो चुंबकीय विद्युत लिंक्ड)

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

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ब्लू multiprotein परिसर के सेलुलर lysates से विश्लेषण के लिए मूल polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (बी एन पृष्ठ)

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

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में प्रोटीन परिसरों की पहचान<em&gt; Escherichia कोलाई</em&gt; संयोजन में अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ अनुक्रमिक पेप्टाइड संबंध शुद्धीकरण का उपयोग

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

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सेल दीवारों की लोचदार संपत्तियों की AFM आधारित मैपिंग: ऊतक, सेलुलर, और Subcellular प्रस्तावों पर

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...