Name: expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast pichia pastoris
Uploaded: 2010-02-25T16:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris at JoVE.com

We willen graag de Canadese Stichting voor Innovatie, de British Columbia Kennis Ontwikkelingsfonds, en de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) bedanken voor de ondersteuning van dit werk. MT werd ondersteund door een beurs van de TULA basis gefinancierd Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie (CMDE).

Expressie van recombinante eiwitten in het methylotrofe gist Pichia pastoris Voordat u begint met dit protocol moet u uw gen van belang gekloond in frame in een P. pastoris ouder vector en hebben gesequenced om te controleren of voor het correct inbrengen van het gen van interesse in de vector. Stap I: Het genereren van elektrocompetente gistcellen, linearisatie van de constructie en transformatie naar P. pastoris <p class="jove_content...

<ol>
	<li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+yeast+in+biotechnology:+protein+production+and+genetic+analysis.">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li><li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations.">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li><li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris.">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li><li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris.">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li></ol>

Eiwitexpressie het gebruik van de methylotrofe gist Pichia pastoris als host systeem is beschreven in dit protocol. Het eiwit kan worden uitgescheiden in het medium afhankelijk van de gebruikte kloneringsvector. De afscheiding van het recombinante eiwit maakt de daaropvolgende zuivering eenvoudiger. Kan echter de getoonde voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor de expressie van verschillende eiwitten en veranderingen in de voorwaarden en expressie tijden kan leiden tot verhoogde eiwit-niveaus. De vector ...

expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast pichia pastoris

Eiwitexpressie in de microbiële eukaryotische gastheer Pichia pastoris biedt de mogelijkheid om grote hoeveelheden recombinant eiwit te genereren op een snelle en eenvoudig te gebruiken expressie systeem. Als een eencellige micro-organisme P. pastoris is gemakkelijk te manipuleren en groeit snel op goedkope media bij hoge celdichtheden. Omdat een eukaryoot, P. pastoris is in staat om vele van de post-translationele modificaties uitgevoerd door hogere eukaryotische cellen en de verkregen recombinante eiwitten ondergaan het vouwen van eiwitten, proteolytische verwerking, disulfidebinding vorming en glycosylatie [1]. Als een methylotrofe gist P. pastoris is in staat van metaboliserende methanol als enige koolstofbron. De sterke promotor voor alcohol oxidase, AOX1, wordt strak gereguleerd en veroorzaakt door methanol en het wordt gebruikt voor de expressie van het gen van belang. Bijgevolg kan de expressie van het vreemde eiwit geïnduceerd worden door het toevoegen van methanol aan het groeimedium [2, 3]. Een ander belangrijk voordeel is de afscheiding van het recombinante eiwit in het groeimedium, met behulp van een signaalsequentie voor de vreemde eiwitten te richten op de secretieroute van P. pastoris. Met slechts lage niveaus van endogene eiwit afgescheiden aan de media door de gist zelf en geen toegevoegde eiwitten aan de media, een heteroloog eiwit bouwt het grootste deel van de totale hoeveelheid eiwit in het medium en faciliteert volgende eiwit zuiveringsstappen [3, 4]. De hier gebruikte vector (pPICZαA) bevat de AOX1 promotor voor strak geregeld, methanol-geïnduceerde expressie van het gen van belang, de α-factor secretie signaal voor secretie van het recombinante eiwit, een Zeocin resistentiegen voor selectie in zowel E. coli en Pichia en een C-terminale peptide met de c-myc epitoop en een polyhistidine (6xHis) tag voor detectie en zuivering van een recombinant eiwit. We laten ook zien western blot-analyse van het recombinante eiwit met behulp van de specifieke anti-myc-HRP antilichaam dat de c-myc epitoop op de bovenliggende vector.

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris at JoVE.com

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Het protocol beschrijft het gebruik van de eiwitexpressie methylotrofe gist<em&gt; Pichia pastoris</em&gt;. De voorbereiding van elektrocompetente gistcellen, transformatie van de vector met het gen van interesse in<em&gt; P. pastoris</em&gt; En gist DNA-zuivering zijn ook uitgevoerd. Western blot analyse en eiwit zuivering te bouwen de laatste stappen in dit eiwit expressie protocol.

Expressie van recombinante eiwitten in het methylotrofe gist Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Screening Kwantitatieve Expressie en zuivering Toegepast op Recombinant Disulfide-rijke Venom eiwitten die in<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Voorbijgaande expressie van eiwitten door Hydrodynamic Gene Levering in Muizen

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Bepaling van de Relatieve celoppervlak en Total Expressie van recombinant Ion kanalen met flowcytometrie

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...