Name: expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast pichia pastoris
Uploaded: 2010-02-25T16:50:00
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我々はこの作業を支援するためのイノベーション、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金、及び保健研究（CIHR）のカナダの協会のためのカナダの財団に感謝の意を表します。 MTは、微生物の多様性と進化（CMDE）用トゥーラ基礎資金センターからのフェローシップでサポートされていました。

メチロトローフ酵母 Pichia pastorisにおける組換えタンパク質の発現このプロトコルを開始する前に、P.フレームでクローニングされた目的の遺伝子を持つ必要がありますそれは、ベクトルで、目的の遺伝子の正しい挿入を確認するためにパストリス親ベクトルと配列を決定している。 ステップI：、P.への構築と変形の線?...

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	<li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+yeast+in+biotechnology:+protein+production+and+genetic+analysis.">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li><li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations.">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li><li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris.">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li><li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris.">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li></ol>

ホストシステムとしてメチロトローフ酵母Pichia pastorisにを使用してタンパク質発現は、このプロトコルで説明されています。タンパク質は、使用されるクローニングベクターに応じて、培地中に分泌することができます。組換えタンパク質の分泌は、その後の精製が容易になります。しかし、示した条件が増加し、タンパク質レベルで生じることが条件と発現時間の異なる蛋白質と変?...

expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast pichia pastoris

微生物、真核宿主ピキアパストリスのタンパク質発現は、高速で使いやすい発現系で組換えタンパク質を大量に生成する可能性を提供しています。 単細胞微生物P.としてピキアパストリスは、操作が容易であり、高い細胞密度で安価なメディアに急速に成長する。真核生物、P.ビーイングピキアパストリスは、高等真核細胞および得られた組換えタンパク質によって行われる翻訳後修飾の多くは、タンパク質フォールディング、タンパク質分解処理、ジスルフィド結合形成、グリコシル化[1]を受け実行することができます。 メチロトローフ酵母P.としてピキアパストリスは、その唯一の炭素源としてメタノールを代謝することが可能です。アルコールオキシダーゼ、AOX1、のための強力なプロモーターは、厳重に規制されているとメタノールで誘導し、それが目的の遺伝子の発現のために使用されています。したがって、外来タンパク質の発現は、増殖培地にメタノールを添加することにより誘導することができる[2、3]。 もう一つの重要な利点は、P.パストリスの分泌経路に外来タンパク質を標的とするシグナル配列を使用して、増殖培地中への組換えタンパク質の分泌です。酵母自体がメディアに分泌される内因性のタンパク質やメディアにない追加のタンパク質だけ低いレベルで、異種蛋白質は培地中の全タンパク質の大部分を構築し、タンパク質の精製の手順に従って容易に[3、4]。 （pPICZαA）ここで用いられるベクターは、目的の遺伝子の厳密に調整、メタノール誘導発現のためのAOX1プロモーターを含み、組換えタンパク質の分泌のためのα-因子分泌シグナル、両方E.で選択ゼオシン耐性遺伝子を大腸菌およびピキアおよび c - mycエピトープと組換えタンパク質の検出および精製の ​​ためのポリヒスチジン（6 ×）タグを含むC末端ペプチド。我々はまた、親のベクトル上のc - mycのエピトープを認識する特定の抗 myc - HRP抗体を用いた組換えタンパク質のウェスタンブロット分析を示す。

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Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

プロトコルは、メチロトローフ酵母を用いたタンパク質の発現を説明します<em&gt;ピキアパストリス</em&gt;。エレクトロ酵母細胞の調製、に興味のある遺伝子を持つベクトルの変換<em&gt; P.ピキアパストリス</em&gt;と酵母のDNA精製も行われている。ウェスタンブロット分析およびタンパク質の精製は、このタンパク質の発現のプロトコルの最後の手順を構築する。

メチロトローフ酵母における組換えタンパク質の発現ピキアパストリス</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

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アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

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High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

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Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

で産生された組換えジスルフィド豊富な毒タンパク質に印加される高スループット定量的発現スクリーニングおよび精製<em&gt; E.大腸菌の</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

マウスにおける流体力学的遺伝子送達によるタンパク質の一過性発現

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...