Name: expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast pichia pastoris
Uploaded: 2010-02-25T16:50:00
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우리는이 작업을 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금, 보건 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. MT는 미생물 다양성과 진화 (CMDE)의 툴라 기초 투자 센터에서 화목에 의해 지원되었다.

methylotrophic 효모 Pichia pastoris의 재조합 단백질의 표현 이 프로토콜을 시작하기 전에 당신은 P.의 프레임에 복제된 관심의 유전자가 있어야 그것은 벡터에 대한 관심의 유전자의 정확한 삽입 확인하는 pastoris의 부모 벡터 및 합성있다. 단계 I : P.으로 구조 변화의 선형화을 electrocompetent 효모 세포를 생성 pastoris <p class="jove_...

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	<li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+yeast+in+biotechnology:+protein+production+and+genetic+analysis.">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li><li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations.">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li><li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris.">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li><li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris.">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li></ol>

호스트 시스템으로 methylotrophic 효모 Pichia pastoris의를 사용하여 단백질 발현이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 단백질이 사용된 복제 벡터에 따라 매체에 분비 수 있습니다. 재조합 단백질의 분비는 이후의 정화가 쉬워집니다. 그러나, 표시 조건이 증가 단백질 수준에서 발생할 수 있습니다 서로 다른 단백질과 조건과 표현 시대의 변화의 표현에 최적해야 할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사?...

expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast pichia pastoris

미생물 진핵 숙주 Pichia pastoris에서 단백질의 표현은 빠르고 사용하기 쉬운 표현 시스템에서 재조합 단백질의 높은 금액을 생성할 수있는 가능성을 제공합니다. 단세포 미생물로서 P. pastoris는 조작하기 쉬운 높은 세포 밀도에서 저렴한 미디어에 빠르게 자랍니다. 진핵세포 생물, P. 웰빙 pastoris 높은 진핵 세포 얻은 재조합 단백질에 의해 수행 사후 translational 수정의 많은 단백질 접힘, proteolytic 처리, 이황화 결합 형성과 글리코 실화 [1]를 받아야 수행할 수 있습니다. methylotrophic 효모 P.으로 pastoris는 유일한 탄소 소스로 메탄올을 metabolizing이 가능합니다. 알코올 산화 효소, AOX1에 대한 강력한 발기인은 밀접하게 규제와 메탄올에 의해 유도하고 그것은 관심의 유전자의 표현에 사용된다. 따라서, 외국 단백질의 표현은 성장 매체 메탄올을 추가하여 유도된 수있다 [2, 3]. 또 다른 중요한 장점은 P. pastoris의의 분비 경로로 외국 단백질을 대상으로 신호 시퀀스를 사용하여 성장 매체로 재조합 단백질의 분비이다. 효모 자체로 미디어에 분비 내생 단백질과 언론 노 추가 단백질만을 낮은 수준, heterologous 단백질은 매체에있는 총 단백질의 대부분을 빌드하고 단백질 정화 단계에 따라 용이하게 [3, 4]. 재조합 단백질, E. 모두 선택할 Zeocin 저항 유전자의 분비에 대한 α - 계수 분비 신호, 여기에 사용되는 벡터는 (pPICZαA) 관심있는 유전자의 꽉 규제, 메탄올 유도된 표현 AOX1 발기인을 포함 대장균과 Pichia 및 C - myc 에피토프 및 재조합 단백질의 감지 및 정화를위한 polyhistidine (6xHis) 태그를 포함하는 C - 말단 펩타이드. 우리는 또한 부모 벡터의 C - myc의 에피토프을 인식하는 특정 안티 - myc - HRP 항체를 사용하여 재조합 단백질의 서양 얼룩 분석을 보여줍니다.

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Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

프로토콜은 methylotrophic 누룩을 사용하여 단백질 발현을 설명합니다<em&gt; Pichia pastoris의</em&gt;. electrocompetent 효모 세포의 준비, 관심의 유전자에있는 벡터의 변화<em&gt; P. pastoris</em&gt;과 효모 DNA 정화도 수행됩니다. 서양 얼룩 분석 및 단백질 정화는이 단백질 표현 프로토콜의 마지막 단계를 빌드합니다.

Methylotrophic 효모에서 재조합 단백질의 표현 Pichia pastoris의</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

연구

생물학

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화<em&gt; E. 대장균</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

마우스의 수력 학적 유전자 전달에 의한 단백질의 일시적 발현

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

유동 세포 계측법을 사용하여 재조합 이온 채널의 상대 셀 표면 및 전체 식의 결정

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...