Name: expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast pichia pastoris
Uploaded: 2010-02-25T16:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento, e os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) para apoiar este trabalho. MT foi apoiado por uma bolsa da Fundação Centro TULA financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution (CMDE).

Expressão de proteínas recombinantes em levedura Pichia pastoris metilotróficas Antes de iniciar este protocolo você deve ter seu gene de interesse clonado no quadro em um P. vector pastoris pai e tê-lo seqüenciado para verificar a correta inserção do gene de interesse no vector. Etapa I: Geração de células de levedura electrocompetent, linearização da construção e transformação em P. pastoris <p class="jove_co...

<ol>
	<li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+yeast+in+biotechnology:+protein+production+and+genetic+analysis.">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li><li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations.">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li><li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris.">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li><li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris.">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li></ol>

Expressão da proteína usando a levedura Pichia pastoris metilotróficas como um sistema host é descrita neste protocolo. A proteína pode ser secretado para o meio, dependendo do vector de clonagem usado. A secreção da proteína recombinante faz a purificação subseqüente mais fácil. No entanto, as condições mostradas podem ter que ser otimizado para a expressão de proteínas diferentes e mudanças nas condições e tempos de expressão pode resultar em níveis de proteínas. O vetor utilizado neste ...

expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast pichia pastoris

Expressão da proteína na Pichia pastoris eucarióticas anfitrião microbiana oferece a possibilidade de gerar grandes quantidades de proteína recombinante em um sistema de expressão rápida e fácil de usar. Como um microorganismo unicelular P. pastoris é fácil de manipular e cresce rapidamente em meios baratos em altas densidades celulares. Ser um eucariota, P. pastoris é capaz de executar muitas das modificações pós-translacionais executada por células eucarióticas e as proteínas recombinantes obtidas sofrer dobramento de proteínas, processamento proteolítico, formação da ligação dissulfeto e glicosilação [1]. Como um metilotróficas levedura P. pastoris é capaz de metabolizar metanol como única fonte de carbono. O promotor forte para oxidase de álcool, AOX1, é estreitamente regulada e induzidos pelo metanol e é usado para a expressão do gene de interesse. Assim, a expressão da proteína estranha pode ser induzida pela adição de metanol ao meio de crescimento [2, 3]. Outra vantagem importante é a secreção de proteína recombinante para o meio de crescimento, usando uma seqüência de sinais como alvo a proteína estranha à via de excreção de P. pastoris. Com apenas baixos níveis de proteína endógena secretada à mídia pela levedura em si e não proteínas adicionadas aos meios de comunicação, uma proteína heteróloga constrói a maioria das proteínas totais no médio e facilita seguintes etapas de purificação de proteínas [3, 4]. O vetor usado aqui (pPICZαA) contém o promotor AOX1 para bem regulamentada, a expressão de metanol induzida do gene de interesse; o sinal de secreção de α-fator para a secreção da proteína recombinante, um gene de resistência Zeocin para a seleção em ambos os E. coli e Pichia e um peptídeo C-terminal contendo o epítopo c-myc e um polyhistidine tag (6xHis) para a detecção e purificação de proteína recombinante. Mostramos também a análise de western blot a proteína recombinante usando o anticorpo anti-myc-HRP específica reconhecendo o epítopo c-myc no vetor pai.

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris at JoVE.com

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

O protocolo descreve a expressão da proteína utilizando a levedura metilotróficas<em&gt; Pichia pastoris</em&gt;. A preparação de células de levedura electrocompetent, a transformação do vetor com o gene de interesse em<em&gt; P. pastoris</em&gt; E purificação do DNA de levedura também são realizados. Ocidental blot e purificação de proteínas construir os últimos passos neste protocolo expressão da proteína.

Expressão de proteínas recombinantes em levedura metilotróficas Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica Gene Entrega em Ratos

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...