Name: expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast pichia pastoris
Uploaded: 2010-02-25T16:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a la Fundación Canadiense para la Innovación, el British Columbia Fondo de Desarrollo de conocimientos, y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) para apoyar este trabajo. MT fue apoyado por una beca de la Fundación Centro TULA financiado por la diversidad microbiana y la evolución (CMDE).

Expresión de proteínas recombinantes en la levadura Pichia pastoris metilotrófica Antes de iniciar este protocolo que debe tener su gen de interés clonado en el marco de una P. vector pastoris padres y lo han secuenciado para comprobar la correcta inserción del gen de interés en el vector. Paso I: La generación de células de levadura electrocompetentes, linealización de la construcción y transformación en P. pastoris </p...

<ol>
	<li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+yeast+in+biotechnology:+protein+production+and+genetic+analysis.">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li><li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations.">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li><li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris.">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li><li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris.">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li></ol>

Expresión de la proteína con la levadura Pichia pastoris metilotrófica como sistema anfitrión se describe en este protocolo. La proteína puede ser secretada en el medio en función del vector de clonación usada. La secreción de la proteína recombinante hace más fácil la posterior purificación. Sin embargo, las condiciones que se muestran pueden tener que ser optimizado para la expresión de proteínas diferentes y los cambios en las condiciones y los tiempos de la expresión puede resultar en niveles...

expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast pichia pastoris

Expresión de la proteína microbiana en el pastoris eucariotas Pichia anfitrión ofrece la posibilidad de generar grandes cantidades de proteínas recombinantes en un sistema de expresión rápida y fácil de usar. Como P. microorganismos unicelulares pastoris es fácil de manipular y crece rápidamente en los medios de comunicación de bajo costo en altas densidades de células. Ser una célula eucariota, P. pastoris es capaz de realizar muchas de las modificaciones posteriores a la traducción realizada por el aumento de las células eucariotas y las proteínas recombinantes obtenidas se someten plegamiento de proteínas, procesamiento proteolítico, la formación de enlaces disulfuro y glicosilación [1]. Como la levadura metilotrófica P. pastoris es capaz de metabolizar el metanol como única fuente de carbono. El gran promotor de la alcohol oxidasa, AOX1, está estrechamente regulada e inducidos por el metanol y se utiliza para la expresión del gen de interés. En consecuencia, la expresión de la proteína extraña puede ser inducida mediante la adición de metanol en el medio de cultivo [2, 3]. Otra ventaja importante es la secreción de la proteína recombinante en el medio de cultivo, utilizando una secuencia de señales para orientar la proteína extraña a la vía secretora de P. pastoris. Con bajos niveles de proteína endógena secretada a los medios de comunicación por la propia levadura y no proteínas añadidas a los medios de comunicación, una proteína heteróloga se basa la mayoría de las proteínas totales en el medio y facilita los siguientes pasos de purificación de proteínas [3, 4]. El vector utilizado (pPICZαA) contiene el promotor AOX1 para mejor regulado, metanol inducida por la expresión del gen de interés, la señal de secreción de α-factor de la secreción de la proteína recombinante, un gen de resistencia Zeocin para la selección, tanto en E. coli y Pichia y un péptido C-terminal que contiene el epítopo c-myc y polihistidina (6xHis) etiqueta para la detección y purificación de proteínas recombinantes. También muestra el análisis de Western blot de la proteína recombinante utilizando el específico anti-myc-HRP anticuerpo que reconoce el epítopo c-myc en el vector de los padres.

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris at JoVE.com

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

El protocolo describe la expresión de proteínas utilizando la levadura metilotrófica<em&gt; Pichia pastoris</em&gt;. La preparación de células de levadura electrocompetentes, la transformación del vector con el gen de interés en<em&gt; P. pastoris</em&gt; Y purificación del ADN de levadura también se realizan. Western blot y purificación de proteínas construir los últimos pasos en este protocolo expresión de la proteína.

Expresión de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Investigación

Biología

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

De alto rendimiento de purificación de afinidad de proteínas marcadas con recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Screening Expresión cuantitativa y Purificación Aplicada a Recombinante Disulfide ricos en proteínas del veneno Producido en<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Expresión transitoria de proteínas por hidrodinámico entrega de genes en ratones

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Determinación de la superficie celular y Expresión relativa total de canales de iones recombinante mediante citometría de flujo

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Expresión transitoria y localización celular de proteínas recombinantes en células cultivadas de insectos

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...