Name: expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast pichia pastoris
Uploaded: 2010-02-25T16:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris at JoVE.com

Vi vill tacka det kanadensiska institutet för innovation, British Columbia Kunskap utvecklingsfonden, och den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) för att stödja detta arbete. MT fick stöd av ett stipendium från Tula stiftelsen finansierade Centrum för Mikrobiell diversitet och evolution (CMDE).

Expression av rekombinanta proteiner i methylotrophic jäst Pichia pastoris Innan du börjar detta protokoll bör du ha din genen av intresse klonas i ram i en P. vektor pastoris förälder och ha det sekvenserade att kontrollera om rätt att genen av intresse i Vector. Steg I: Generera electrocompetent jästceller, linjärisering av konstruktionen och omvandling till P. pastoris För detta steg behöve...

<ol>
	<li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+yeast+in+biotechnology:+protein+production+and+genetic+analysis.">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li><li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations.">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li><li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris.">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li><li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris.">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li></ol>

Protein uttryck med methylotrophic pastoris jästen Pichia som ett värdsystem beskrivs i detta protokoll. Proteinet kan utsöndras i mediet beroende på vilken kloningsvektor. Utsöndring från rekombinant protein gör den efterföljande rening lättare. Kan dock visat villkor måste vara optimerade för uttryck av olika proteiner och förändringar i de villkor och tider uttryck kan resultera i ökad protein nivåer. Den vektor som används i detta protokoll har funktionen av en c-Myc epitop...

expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast pichia pastoris

Protein uttryck i den mikrobiella eukaryota värd Pichia pastoris ger möjlighet att generera höga halter av rekombinant protein i ett snabbt och enkelt att använda uttryck system. Som en encelliga mikroorganismer s. pastoris är lätt att manipulera och växer snabbt på billiga medier vid höga cell tätheter. Att vara en eukaryota, s. pastoris kan utföra många av post-translationella modifieringar som utförs av högre eukaryota celler och de erhållna rekombinanta proteiner genomgår proteinveckning, proteolytiska bearbetning, disulfid band bildas och glykosylering [1]. Som en methylotrophic jäst P. pastoris kan metaboliserande metanol som enda kolkälla. Den starka promotor för alkohol oxidas, AOX1, är hårt reglerad och induceras av metanol och det används för uttrycket av genen av intresse. Följaktligen kan uttrycket av den främmande protein sättas igång genom att lägga till metanol till odlingsmedium [2, 3]. En annan viktig fördel är utsöndring av rekombinant protein i odlingsmedium, med hjälp av en signal sekvens för att rikta främmande protein till Utsöndringsvägarna av P. pastoris. Med endast låga nivåer av endogent protein som utsöndras till media av jästen själv och utan tillsats av proteiner till media, bygger en heterologa proteiner majoriteten av det totala proteininnehållet på medellång och underlättar följande steg proteinrening [3, 4]. Den vektor som används här (pPICZαA) innehåller AOX1 promotor för hårt reglerad, metanol-inducerad uttryck av genen av intresse, det α-faktorn sekretion signal för sekretion av rekombinant protein, en Zeocin motstånd genen för val i både E. coli och Pichia och en C-terminal peptid som innehåller c-Myc epitopen och en polyhistidine (6xHis) tag för att upptäcka och rening av ett rekombinant protein. Vi visar även Western Blot analys av rekombinanta proteiner med hjälp av specifika anti-Myc-HRP antikropp erkänna c-Myc epitopen på den överordnade vektor.

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris at JoVE.com

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protokollet beskriver protein uttryck med methylotrophic jäst<em&gt; Pichia pastoris</em&gt;. Beredningen av electrocompetent jästceller, omvandling av vektorn med genen av intresse i<em&gt; P. pastoris</em&gt; Och jäst DNA-rening utförs också. Western blot analys och proteinrening bygga de sista stegen i denna protein expression protokoll.

Expression av rekombinanta proteiner i Methylotrophic Jäst Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Hög genomströmning Rening av Affinity-märkta rekombinanta proteiner

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effektiv Agroinfiltration av växter för hög nivå Transient Expression av rekombinanta proteiner

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Temporal Kvantifiering av MAPK inducerat uttryck i Single jästceller

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Hög genomströmning Kvantitativ Expression Screening och rening Tillämpat på rekombinant Disulfide rika Venom proteiner som produceras i<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Transient Expression av proteiner från Hydrodynamisk Gene Delivery hos möss

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Hög Utbyte Expression av rekombinanta humana proteiner med transient transfektion av HEK293 celler i suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Fastställande av den relativa cellytan och Total Expression av rekombinant jonkanaler med flödescytometri

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Transient expression och cellulär lokalisering av rekombinanta proteiner i odlade insektsceller

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...