Name: analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast
Uploaded: 2010-03-24T16:05:00
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<p class="jove_content">我々は有用な議論とサポートのためにブライアンG.クーンとクラウディアB.ハンナに感謝。このプロジェクトは出発から立ち上げ資金によってサポートされていました。生物科学、R.クラウディオアギラとパーデュー大学がんセンター経由R.クラウディオアギラに米国癌学会機関の研究助成にパデュー大学。 </p>

<p class="jove_title"> A.細胞培養やタンパク質誘導</p><p class="jove_content">このセクションでは、酵母細胞内の調節可能なプロモーターからタンパク質の発現誘導に続いて細胞の培養条件、ノコダゾールによる細胞周期の同期を、説明します。 </p><ol><li>野生型の酵母株<em>W303（LEU2 - 3、112 TRP1 - 1 CAN1 - 100 URA3 - 1 ADE2 - 1 HIS3 - 11、15）</em>の制御下に興味のある私たちの遺伝子を含む高コピー（2μ）プラスミドDNA（ENTH2）で形...

<ol>
	<li>R&#246;nicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> <em style='font-style: italic'>Methods Enzymol</em>. <b>283</b>, 313-322 (1997).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach</em>. , 121-134 (1994).</li><li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway.">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Sci</em>. <b>122</b>, 2453-2463 (2009).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology</em>. , 3-21 (1991).</li></ol>

<p class="jove_content">このプロトコルは、タンパク質の過剰発現時に形態学的表現型（適切な細胞分裂を受けることができない酵母細胞）の開発を監視する方法について説明します。この手順を行うときは、それより速いスピードで細胞や不明瞭な結果を傷める可能性がありますので、推奨遠心速度で沈殿させ、酵母細胞を採取することを忘れないことが重要です。メチレンブルーとCalcofluor白は、それらが有毒で...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nocodazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>M1404</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene Blue 1% (w/v)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW6276-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcofluor White</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>F3543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petroleum Jelly</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW3339-2</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast

<p class="jove_content">遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述する<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;。このプロトコルは、タンパク質の過剰発現に基づいていますが、それは容易にタンパク質発現の抑制に依存する形態学的表現型に適合させることができる。私たちの研究室では、エンドサイトーシスのアダプタータンパク質のepsinのシグナル伝達特性の研究に興味を持っています。その目的のために我々が保存を過剰発現しているドミナントネガティブアプローチを使用<u&gt; E</u&gt; psin<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; erminal<u&gt; H</u内因性epsin - 2（Ent2またはYLR206W）の機能と干渉するために&gt; omology（ENTH）ドメイン。我々は、足場タンパク質、septinsの家族のmislocalizationに依存している細胞分裂の欠陥につながった野生型細胞でEnt2（ENTH2）のENTHドメインの過剰発現を観察した。</p>

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Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

<p class="jove_content">遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述する<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;。</p>

出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

ラットの歩行の質的分析のための方法としてRotorodの使用

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

出芽酵母の複製寿命の測定

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Using <em>Caenorhabditis elegans</em> as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...