Name: analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast
Uploaded: 2010-03-24T16:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast at JoVE.com

<p class="jove_content"> Agradecemos a Brian G. Coon e Claudia B. Hanna para discussões úteis e de apoio. Este projecto foi apoiado pelo start-up fundos do Dep. de Ciências Biológicas, da Universidade Purdue de Claudio R. Aguilar e um American Cancer Society Research Grant Institucional de Claudio R. Aguilar através do Centro de Câncer Purdue. </p>

<p class="jove_title"> A. Cultura de Células e indução de proteínas </p><p class="jove_content"> Esta seção descreve as condições de cultura celular, ciclo celular sincronização com Nocodazol, seguida de indução da expressão da proteína a partir de um promotor regulável em células de levedura. </p><ol><li> A cepa de levedura tipo selvagem W303 <em>(leu2-3, 112 trp1-1 CAN1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15)</em> é transformada com cópia de alta (2μ) DNA plasmídeo que contém o nosso gene de interesse (ENTH2) sob o controle de um ...

<ol>
	<li>R&#246;nicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> <em style='font-style: italic'>Methods Enzymol</em>. <b>283</b>, 313-322 (1997).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach</em>. , 121-134 (1994).</li><li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway.">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Sci</em>. <b>122</b>, 2453-2463 (2009).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology</em>. , 3-21 (1991).</li></ol>

<p class="jove_content"> Este protocolo descreve como monitorar o desenvolvimento de um fenótipo morfológico (célula de levedura capaz de se submeter a divisão celular propriamente dita) sobre superexpressão da proteína. Ao fazer este procedimento é importante para se lembrar de colher células de levedura por peletização na velocidade de centrifugação recomendada como velocidades mais rápidas podem danificar as células e os resultados obscuros. Azul de metileno e calcofluor branco deve ser adicionado ao vivo células pouco antes d...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nocodazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>M1404</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene Blue 1% (w/v)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW6276-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcofluor White</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>F3543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petroleum Jelly</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW3339-2</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast

<p class="jove_content">Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em níveis<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Embora este protocolo é baseado na superexpressão de uma proteína, que pode facilmente ser adaptado para fenótipos morfológicos dependente supressão da expressão da proteína. Nosso laboratório está interessado em estudar as propriedades de sinalização do epsin endocítica adaptador de proteína. Para esse fim foi utilizada uma abordagem dominante negativo em que expressou a over-conservada<u&gt; E</u&gt; Psin<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; Erminal<u&gt; H</u&gt; Omology domínio (ENTH), a fim de interferir com as funções de endógenos epsin-2 (Ent2 ou YLR206W). Observamos que a superexpressão do domínio ENTH de Ent2 (ENTH2) em células de tipo selvagem levou a um defeito de divisão celular que é dependente do mislocalization de uma família de proteínas andaimes, septinas.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast at JoVE.com

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

<p class="jove_content">Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em níveis<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;.</p>

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Uso de Rotorod como um método de análise qualitativa de Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Biologia

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

A importância da concentração de proteína correta para Cinética e Determinação Affinity na estrutura-função Análise

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Using <em>Caenorhabditis elegans</em> as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...