Name: fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method
Uploaded: 2010-11-02T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method at JoVE.com

De auteurs willen graag dank de leden van de Houston lab voor de kritische lezing van het manuscript. Onderzoek wordt ondersteund door de National Institutes of Health (GM083999) toegekend aan DWH

1. Chirurgische verwijdering van de eierstokken Tissue <ol class="lalpha"><li> Maak een nieuwe partij van eicel kweekmedium (OCM, Materials), tussen 400 tot 800 ml, afhankelijk van de grootte van het experiment. Stel de pH op 7,6-7,8, totdat de fenol rood wordt een donkere rode kleur (zes of zo kleine druppeltjes van 5 N NaOH). Giet een klein bedrag om de pH te controleren in een aparte buis, omdat de pH-elektrode schadelijk zijn voor de media. OCM moet worden bewaard bij 18 ° C en binnen een week. </li><li> Selectee...

<ol>
	<li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+in+vitro:+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis.">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li><li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos.">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li><li>Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axis+and+germ+line+deficiencies+caused+by+u.v+irradiation+of+Xenopus+oocytes+cultured+in+vitro.">Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro.</a> Development. 100, 735-743 (1987).</li><li>Houston, D. W., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+Xdazl,+a+germ+plasm-localized+RNA,+in+the+differentiation+of+primordial+germ+cells+in+Xenopus.">A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus.</a> Development. 127, 447-456 (2000).</li><li>Mir, A., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+mother+can+help:+studying+maternal+Wnt+signaling+by+anti-sense-mediated+depletion+of+maternal+mRNAs+and+the+host+transfer+technique.">How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique.</a> Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).</li><li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Embryology: Techniques and procedures. , (1962).</li><li>Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+physiological+maturation+in+Rana+pipiens+oocytes+removed+from+their+ovarian+follicles.">In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles.</a> Dev Biol. 17, 627-643 (1968).</li><li>Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+and+oocyte+isolation.">Oogenesis and oocyte isolation.</a> Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).</li><li>Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability,+toxicity+and+effectiveness+of+unmodified+and+phosphorothioate+antisense+oligodeoxynucleotides+in+Xenopus+oocytes+and+embryos.">The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos.</a> Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).</li><li>Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+beta-catenin+establishes+a+'dorsal+signal'+in+early+Xenopus+embryos.">Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos.</a> Development. 122, 2987-2996 (1996).</li><li>Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos.">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li><li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+in+Xenopus+embryos:+an+antisense+approach..">Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach..</a> A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. , 341-354 (1998).</li></ol>

Een succesvolle overdracht zal leiden tot een bevruchting en normale splitsing van&gt; 50% van de eicellen (figuur 3). Over het algemeen tussen de 30-60% van de overgedragen eicellen zal overleven langs de neurula fasen. We dragen doorgaans 75 tot 150 eicellen per experimentele groep, die voldoende embryo&#39;s zal opleveren voor verschillende soorten analyses (in situ, RT-PCR) en het visualiseren van het fenotype. Implanteren van aanzienlijk meer eicellen lijkt niet sterk te verhogen de opbrengst. Ook moet minstens 30 ...

Oplossingen en recepten: OCM (oöcyt kweekmedium; gemodificeerd uit Wylie et al., 1996.) <table border="0"><tbody><tr><td> 70% Leibovitz&#39;s L-15 medium (met L-glutamine) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0,4 mg / ml Bovine serum albumine (BSA, fractie V) </td><td> (Sigma A-9418-50g) </td></tr><tr><td> 1x penicilline-streptomycine </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> Aan te passen aan de pH 7,6-7,8 met 5N NaOH </td></tr><tr><td colspan="2"> Het maken van verse wekelijks, bewaren bij 18 ° C. </td></tr></tbody></table> 10X MMR (Marc&#39;s gemodificeerd Ringer-oplossing;. Zuck et al., 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> 1M NaCl </td></tr><tr><td> 20 mM KCl </td></tr><tr><td> 20 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 150 mM HEPES </td></tr><tr><td> aan te passen aan de pH 7,6-7,8 </td></tr><tr><td> Bewaren bij 4 ° C </td></tr></tbody></table> Anestheticum <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-aminobenzoëzuur Ethyl Ester (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> 0,7 g / L natriumbicarbonaat </td></tr><tr><td colspan="2"> Los op in Amquel behandelde water </td></tr><tr><td colspan="2"> Het maken van verse wekelijks </td></tr></tbody></table> Progesteron voorraden <table border="0"><tbody><tr><td> 10 mM Progesteron (Sigma P-0130) in 100% ethanol </td></tr><tr><td> Vul aan tot 1 mM in 100% EtOH voor een 500x voorraad / werkende oplossing </td></tr><tr><td> Bewaren bij -20 ° C </td></tr></tbody></table> Vital kleurstoffen (gemodificeerd van Heasman et al.., 1991) <table border="0"><tbody><tr><td> Blauw: 0,1% Nijl Blue A </td><td> (Aldrich 121479-5G), </td></tr><tr><td> Rood: 0,25% neutraal rood </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Bruin: 1% Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Groen (80 pl blauw + 80 ui bruin), </td></tr><tr><td colspan="2"> Mauve (80 pl blauw + 80 pl rood). </td></tr><tr><td colspan="2"> Een zesde kleur, Orange (80 ul rood + 80 ui bruin), kan ook gebruikt worden, maar is vaak moeilijk te onderscheiden van bruin. </td></tr></tbody></table> Voorraden van Blauw, rood en bruin zijn opgebouwd in gedeïoniseerd water in 50 ml buizen, geïncubeerd gedurende 20 minuten met schommelen en gesponnen in een klinische centrifuge. De supernatant aliquotted in microfugebuizen buizen en opgeslagen bij -20 ° C.

fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method

Het bestuderen van de bijdrage van de moeder geërfd moleculen tot de vroege ontwikkeling gewervelde wordt vaak gehinderd door de tijd en kosten die nodig zijn om de moeder-effect mutant dieren te genereren. Bovendien, veel van de technieken om overexpressie of genfunctie remmen in organismen zoals Xenopus en zebravis niet voldoende kritische doelgroep van moeders signaalwegen, zoals de Wnt-signalering. In Xenopus, kan manipuleren genfunctie in gekweekte eicellen bevruchten en vervolgens te verbeteren deze problemen tot op zekere hoogte. Eicellen worden handmatig defolliculated van donor eierstok weefsel, geïnjecteerd of worden behandeld in de cultuur als gewenst, en vervolgens gestimuleerd met progesteron tot rijping te induceren. Vervolgens worden de eicellen ingebracht in de lichaamsholte van een eisprong gastheer vrouwelijke kikker, waarna ze zullen worden getransloceerd via eileider van de gastheer en het verwerven van modificaties en gelei lagen nodig zijn voor de bevruchting. De resulterende embryo&#39;s kunnen vervolgens worden verhoogd tot het gewenste stadium en geanalyseerd op de gevolgen van een eventuele experimentele verstoringen. Deze host-transfer methode is zeer effectief in het blootleggen van fundamentele mechanismen van de vroege ontwikkeling en maakt een breed scala aan experimentele mogelijkheden niet beschikbaar in alle andere gewervelde modelorganisme.

Watch this Scientific Journal Video about Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method at JoVE.com

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure voor bemesting<em&gt; Xenopus oöcyten</em&gt; Door de host overdrachtmethode.

Bemesting van Xenopus oöcyten Het gebruik van de Host Transfer Methode

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear Transfer naar Mouse Eicellen

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Retrieval of Mouse Oocytes

Ophalen van Muis Eicellen

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

In Vitro Nuclear Assembly Met behulp van Gefractioneerde Xenopus Egg Extracten

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Een high-throughput-methode voor zebravis sperma cryopreservatie en In Vitro Bevruchting

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Het visualiseren van RNA Lokalisatie in Xenopus Eicellen

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Weefsel Bepaling Met behulp van de Animal Cap Transplantatie (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Studie van de DNA-schade Checkpoint met behulp van<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extracten

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...