Name: fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method
Uploaded: 2010-11-02T17:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire de Houston pour la lecture critique du manuscrit. La recherche est soutenue par le National Institutes of Health (GM083999) attribué à DWH

1. Ablation chirurgicale du tissu Ovaire <ol class="lalpha"><li> Préparer un nouveau lot de milieu de culture des ovocytes (OCM; Matériaux), entre 400 à 800 ml selon la taille de l&#39;expérience. Ajuster le pH de 07.06 à 07.08, jusqu&#39;à ce que le rouge de phénol vire au rouge foncé (six ou si de petites gouttes de NaOH 5N). Verser une petite quantité de vérifier le pH dans un tube séparé depuis l&#39;électrode pH peut contaminer les médias. OCM doit être conservé à 18 ° C et utilisée dans une se...

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	<li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+in+vitro:+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis.">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li><li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos.">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li><li>Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axis+and+germ+line+deficiencies+caused+by+u.v+irradiation+of+Xenopus+oocytes+cultured+in+vitro.">Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro.</a> Development. 100, 735-743 (1987).</li><li>Houston, D. W., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+Xdazl,+a+germ+plasm-localized+RNA,+in+the+differentiation+of+primordial+germ+cells+in+Xenopus.">A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus.</a> Development. 127, 447-456 (2000).</li><li>Mir, A., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+mother+can+help:+studying+maternal+Wnt+signaling+by+anti-sense-mediated+depletion+of+maternal+mRNAs+and+the+host+transfer+technique.">How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique.</a> Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).</li><li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Embryology: Techniques and procedures. , (1962).</li><li>Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+physiological+maturation+in+Rana+pipiens+oocytes+removed+from+their+ovarian+follicles.">In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles.</a> Dev Biol. 17, 627-643 (1968).</li><li>Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+and+oocyte+isolation.">Oogenesis and oocyte isolation.</a> Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).</li><li>Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability,+toxicity+and+effectiveness+of+unmodified+and+phosphorothioate+antisense+oligodeoxynucleotides+in+Xenopus+oocytes+and+embryos.">The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos.</a> Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).</li><li>Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+beta-catenin+establishes+a+'dorsal+signal'+in+early+Xenopus+embryos.">Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos.</a> Development. 122, 2987-2996 (1996).</li><li>Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos.">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li><li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+in+Xenopus+embryos:+an+antisense+approach..">Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach..</a> A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. , 341-354 (1998).</li></ol>

Un transfert réussi aboutira à la fécondation et de clivage normal de&gt; 50% des ovocytes (Figure 3). Généralement entre 30-60% des ovocytes transfert va survivre dernières étapes neurula. Nous transfèrent habituellement de 75 à 150 ovocytes par groupe expérimental, ce qui donnera suffisamment d&#39;embryons pour plusieurs types d&#39;analyses (in situ, RT-PCR) ainsi que la visualisation du phénotype. L&#39;implantation d&#39;ovocytes nettement plus ne semble pas augmenter considérablement le rendement. En ...

Solutions et recettes: OCM (milieu de culture des ovocytes; modifiées de Wylie et al, 1996). <table border="0"><tbody><tr><td> 70% Leibovitz milieu L-15 (contenant de la L-glutamine) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0,4 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA; fraction V) </td><td> (Sigma A-9418-50g) </td></tr><tr><td> 1x pénicilline-streptomycine </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajuster le pH à 7.6 au 7.8 avec NaOH 5N </td></tr><tr><td colspan="2"> Faire frais hebdomadaires, stocker à 18 ° C. </td></tr></tbody></table> 10X ROR (Solution de Marc modification de Ringer;. Zuck et al, 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> NaCl 1M </td></tr><tr><td> 20 mM de KCl </td></tr><tr><td> 20 mM de CaCl2 </td></tr><tr><td> MgCl2 10 mM </td></tr><tr><td> 150 mM d&#39;HEPES </td></tr><tr><td> ajuster le pH à 7.6 au 7.8 </td></tr><tr><td> Conserver à 4 ° C </td></tr></tbody></table> Une solution d&#39;anesthésique <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-aminobenzoïque ester éthylique d&#39;acide (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> Bicarbonate de sodium 0,7 g / L </td></tr><tr><td colspan="2"> Dissoudre dans l&#39;eau traitée Amquel </td></tr><tr><td colspan="2"> Faire frais hebdomadaires </td></tr></tbody></table> Stocks de progestérone <table border="0"><tbody><tr><td> 10 mM de progestérone (Sigma P-0130) dans l&#39;éthanol à 100% </td></tr><tr><td> Diluer à 1 mM dans EtOH à 100% pour un stock 500x / solution de travail </td></tr><tr><td> Conserver à -20 ° C </td></tr></tbody></table> Colorants vitaux (modifié à partir Heasman et al., 1991) <table border="0"><tbody><tr><td> Bleu: 0,1% du Nil Bleu Une </td><td> (Aldrich 121 479-5G), </td></tr><tr><td> Rouge: 0,25% Rouge Neutre </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Brown: 1% Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Vert (80 bleues + 80 ul ul marron), </td></tr><tr><td colspan="2"> Mauve (80 ul bleues + 80 rouges ul). </td></tr><tr><td colspan="2"> Une couleur sixième, Orange (80 ul rouges + 80 ul brun), peut également être utilisé mais il est souvent difficile à distinguer de brun. </td></tr></tbody></table> Stocks de bleu, rouge et brun sont constitués dans de l&#39;eau déminéralisée dans des tubes de 50 ml, incubée pendant 20 minutes avec bascule et filé dans une centrifugeuse clinique. Les surnageants sont aliquotes dans des tubes de centrifugeuse et conservés à -20 ° C.

fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method

Etudier l&#39;apport de molécules hérité de la mère au développement précoce des vertébrés est souvent entravée par le temps et les dépenses nécessaires pour produire des animaux mutants à effet maternel. De plus, de nombreuses techniques pour surexprimer ou inhiber la fonction des gènes dans des organismes comme le poisson-zèbre et le xénope ne parviennent pas à suffisamment cible critique maternelle voies de signalisation, tels que la signalisation Wnt. Chez le xénope, la manipulation de la fonction des gènes dans les ovocytes en culture et par la suite les fertiliser peut améliorer ces problèmes dans une certaine mesure. Les ovocytes sont manuellement defolliculated à partir de tissus d&#39;ovaire donateurs, injecté ou traité dans la culture comme souhaité, et ensuite stimulées avec de la progestérone pour induire la maturation. Ensuite, les ovocytes sont introduits dans la cavité du corps d&#39;une grenouille hôte ovulation féminine, après quoi ils seront transporté dans l&#39;oviducte de l&#39;hôte et l&#39;acquisition des modifications et des manteaux de gelée nécessaires à la fécondation. Les embryons ainsi obtenus peuvent ensuite être porté à la scène désirée et analysées pour les effets de toute perturbations expérimentales. Cette méthode de transfert de l&#39;hôte a été très efficace dans la découverte des mécanismes de base du développement précoce et permet un large éventail de possibilités expérimentales ne sont pas disponibles dans tous les autres vertébrés organisme modèle.

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Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procédure pour la fertilisation<em&gt; Ovocytes de Xenopus</em&gt; Par la méthode de transmission de l&#39;hôte.

La fertilisation des Ovocytes de Xenopus En utilisant la méthode de transfert d&#39;hôte

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

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Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

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