Name: fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method
Uploaded: 2010-11-02T17:00:00
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Die Autoren möchten sich dank Mitglieder des Houston-Labor für die kritische Durchsicht des Manuskripts wie. Forschung wird durch die National Institutes of Health (GM083999) verliehen DWH unterstützt

1. Chirurgische Entfernung von Eierstockgewebe <ol class="lalpha"><li> Bereiten Sie eine neue Charge der Eizelle Kulturmedium (OCM; Materials), zwischen 400-800 ml, je nach Größe des Experiments. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,6-7,8, bis die Phenolrot wird eine dunkelrote Farbe (sechs oder so kleine Tropfen von 5N NaOH). Gieße eine kleine Menge auf den pH-Wert in einem separaten Röhrchen zu überprüfen, da der pH-Elektrode den Medien verunreinigen können. OCM sollte bei 18 ° C gelagert werden und innerhalb von e...

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	<li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+in+vitro:+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis.">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li><li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos.">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li><li>Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axis+and+germ+line+deficiencies+caused+by+u.v+irradiation+of+Xenopus+oocytes+cultured+in+vitro.">Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro.</a> Development. 100, 735-743 (1987).</li><li>Houston, D. W., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+Xdazl,+a+germ+plasm-localized+RNA,+in+the+differentiation+of+primordial+germ+cells+in+Xenopus.">A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus.</a> Development. 127, 447-456 (2000).</li><li>Mir, A., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+mother+can+help:+studying+maternal+Wnt+signaling+by+anti-sense-mediated+depletion+of+maternal+mRNAs+and+the+host+transfer+technique.">How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique.</a> Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).</li><li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Embryology: Techniques and procedures. , (1962).</li><li>Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+physiological+maturation+in+Rana+pipiens+oocytes+removed+from+their+ovarian+follicles.">In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles.</a> Dev Biol. 17, 627-643 (1968).</li><li>Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+and+oocyte+isolation.">Oogenesis and oocyte isolation.</a> Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).</li><li>Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability,+toxicity+and+effectiveness+of+unmodified+and+phosphorothioate+antisense+oligodeoxynucleotides+in+Xenopus+oocytes+and+embryos.">The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos.</a> Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).</li><li>Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+beta-catenin+establishes+a+'dorsal+signal'+in+early+Xenopus+embryos.">Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos.</a> Development. 122, 2987-2996 (1996).</li><li>Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos.">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li><li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+in+Xenopus+embryos:+an+antisense+approach..">Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach..</a> A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. , 341-354 (1998).</li></ol>

Die erfolgreiche Übertragung wird bei der Befruchtung und normale Spaltung von&gt; 50% der Oozyten (Abbildung 3) führen. In der Regel zwischen 30-60% der transferierten Eizellen wird über die Neurula Stadien überleben. Wir in der Regel übertragen 75-150 Eizellen pro Versuchsgruppe, die genügend Embryonen für verschiedene Arten von Analyse Ausbeute (in situ, RT-PCR) sowie die Visualisierung der Phänotyp. Die Implantation wesentlich mehr Eizellen scheint nicht zu einer deutlichen Steigerung der Rendite. Außerdem ...

Lösungen und Rezepte: OCM (Oocyte Kulturmedium; von Wylie et al modifiziert, 1996.) <table border="0"><tbody><tr><td> 70% Leibovitz L-15-Medium (mit L-Glutamin) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0,4 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA; Fraktion V) </td><td> (Sigma A-9418-50g) </td></tr><tr><td> 1x Penicillin-Streptomycin </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> Passen Sie auf pH 7,6-7,8 mit 5N NaOH </td></tr><tr><td colspan="2"> Machen Sie frische wöchentlich, Lagerung bei 18 ° C. </td></tr></tbody></table> 10X MMR (Modified Marcs Ringer-Lösung;. Zuck et al, 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> 1M NaCl </td></tr><tr><td> 20 mM KCl </td></tr><tr><td> 20 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 150 mM HEPES </td></tr><tr><td> auf pH 7,6-7,8 </td></tr><tr><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr></tbody></table> Anästhesielösung <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-Aminobenzoesäure-ethylester (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> 0,7 g / L Natriumbikarbonat </td></tr><tr><td colspan="2"> Man löst in Amquel-behandeltem Wasser </td></tr><tr><td colspan="2"> Machen Sie frische wöchentlich </td></tr></tbody></table> Progesteron Aktien <table border="0"><tbody><tr><td> 10 mM Progesteron (Sigma P-0130) in 100% Ethanol </td></tr><tr><td> Verdünnen auf 1 mM in 100% EtOH für eine 500x Lager / funktionierende Lösung </td></tr><tr><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr></tbody></table> Vital Farbstoffe (modifiziert nach Heasman et al., 1991) <table border="0"><tbody><tr><td> Blue: 0,1% Nilblau A </td><td> (Aldrich 121479-5G) </td></tr><tr><td> Red: 0,25% Neutral Red </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Brown: 1% Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Grün (80 ul blau + 80 ul braun), </td></tr><tr><td colspan="2"> Mauve (80 ul blau + 80 ul rot). </td></tr><tr><td colspan="2"> Eine sechste Farbe, Orange (80 ul rot + 80 ul braun), kann auch verwendet werden, ist aber oft nur schwer von braun zu unterscheiden. </td></tr></tbody></table> Die Bestände an Blau, Rot und Braun sind in VE-Wasser in 50 ml Tuben gemacht, inkubiert für 20 Minuten mit Schaukeln und drehte in einer klinischen Zentrifuge. Die Überstände werden in Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert und bei -20 ° C.

fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method

Studium der Beitrag der mütterlich vererbten Moleküle frühen Entwicklung Wirbeltieren wird häufig durch die Zeit-und Kostenaufwand notwendig, Mutter-Effekt mutierten Tiere erzeugen behindert. Darüber hinaus werden viele der Techniken zur Überexpression oder Hemmung der Genfunktion in Organismen wie Xenopus und Zebrafisch ausreichend Ziel kritische mütterlichen Signalwege wie Wnt-Signalweg. In Xenopus, kann die Manipulation der Genfunktion in kultivierten Eizellen und anschließend düngen sie diese Probleme zu einem gewissen Grad zu mildern. Die Eizellen werden manuell vom Spender Eierstockgewebe defolliculated, injiziert oder behandelt in der Kultur, wie gewünscht, und dann mit Progesteron stimuliert die Reifung zu induzieren. Anschließend werden die Eizellen in die Körperhöhle ein Eisprung Host weiblichen Frosch eingeführt, worauf sie durch den Host-Eileiter transloziert werden und erwerben Modifikationen und Gelee Mäntel, die für die Befruchtung. Die resultierenden Embryonen können dann auf die gewünschte Stufe angehoben werden und analysiert die Auswirkungen der experimentellen Störungen. Diese Host-Transfer-Verfahren wurde sehr effektiv bei der Aufdeckung von grundlegenden Mechanismen der frühen Entwicklungsphase und ermöglicht eine breite Palette von experimentellen Möglichkeiten nicht in jedem anderen Wirbeltieren Modell-Organismus.

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Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Verfahren zur Düngung<em&gt; Xenopus Oozyten</em&gt; Durch den Host Übertragungsmethode.

Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear Transfer in Maus-Oozyten

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Forschung

Biologie

Retrieval of Mouse Oocytes

Retrieval von Maus-Oozyten

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Untersuchung der DNA Damage Checkpoint mit<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Auszüge

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...