Name: fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method
Uploaded: 2010-11-02T17:00:00
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Gli autori desiderano grazie ai membri del laboratorio di Houston per la lettura critica del manoscritto. La ricerca è supportata dal National Institutes of Health (GM083999) assegnato a DWH

1. La rimozione chirurgica del tessuto dell&#39;ovaio <ol class="lalpha"><li> Preparare un lotto fresco di media cultura ovocita (OCM; Materiali), tra 400-800 ml a seconda delle dimensioni dell&#39;esperimento. Regolare il pH a 7,6-7,8, fino a quando il rosso fenolo trasforma un colore rosso scuro (sei o giù di piccole gocce di NaOH 5N). Versare una piccola quantità di controllare il pH in un tubo a parte in quanto l&#39;elettrodo pH può contaminare i media. OCM deve essere conservato a 18 ° C e utilizzata entro u...

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	<li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+in+vitro:+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis.">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li><li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos.">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li><li>Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axis+and+germ+line+deficiencies+caused+by+u.v+irradiation+of+Xenopus+oocytes+cultured+in+vitro.">Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro.</a> Development. 100, 735-743 (1987).</li><li>Houston, D. W., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+Xdazl,+a+germ+plasm-localized+RNA,+in+the+differentiation+of+primordial+germ+cells+in+Xenopus.">A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus.</a> Development. 127, 447-456 (2000).</li><li>Mir, A., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+mother+can+help:+studying+maternal+Wnt+signaling+by+anti-sense-mediated+depletion+of+maternal+mRNAs+and+the+host+transfer+technique.">How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique.</a> Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).</li><li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Embryology: Techniques and procedures. , (1962).</li><li>Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+physiological+maturation+in+Rana+pipiens+oocytes+removed+from+their+ovarian+follicles.">In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles.</a> Dev Biol. 17, 627-643 (1968).</li><li>Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+and+oocyte+isolation.">Oogenesis and oocyte isolation.</a> Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).</li><li>Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability,+toxicity+and+effectiveness+of+unmodified+and+phosphorothioate+antisense+oligodeoxynucleotides+in+Xenopus+oocytes+and+embryos.">The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos.</a> Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).</li><li>Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+beta-catenin+establishes+a+'dorsal+signal'+in+early+Xenopus+embryos.">Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos.</a> Development. 122, 2987-2996 (1996).</li><li>Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos.">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li><li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+in+Xenopus+embryos:+an+antisense+approach..">Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach..</a> A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. , 341-354 (1998).</li></ol>

Un trasferimento di successo si tradurrà in fertilizzazione e scissione normale&gt; 50% degli ovociti (Figura 3). Generalmente tra 30-60% degli ovociti trasferiti sopravviverà passato le fasi neurula. Di solito il trasferimento 75-150 ovociti per ogni gruppo sperimentale, che sarà resa embrioni sufficiente per diversi tipi di analisi (in situ, RT-PCR), così come visualizzare il fenotipo. L&#39;impianto di ovociti sostanzialmente più non sembra aumentare notevolmente la resa. Inoltre, almeno 30 ovociti per ogni grup...

Soluzioni e ricette: OCM (terreno di coltura degli ovociti; modificato da Wylie et al, 1996). <table border="0"><tbody><tr><td> 70% di L-15 a medio Leibovitz (contenente l-glutammina) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0,4 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA; V frazione) </td><td> (Sigma A-9418-50g) </td></tr><tr><td> 1x penicillina-streptomicina </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiustare il pH a 7,6-7,8 con 5N NaOH </td></tr><tr><td colspan="2"> Fai fresca settimanale, conservare a 18 ° C. </td></tr></tbody></table> 10X MMR (Soluzione di Marc modifica di Ringer;. Zuck et al, 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> 1M NaCl </td></tr><tr><td> 20 mM KCl </td></tr><tr><td> 20 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 150 mM HEPES </td></tr><tr><td> regolare a pH 7,6-7,8 </td></tr><tr><td> Conservare a 4 ° C </td></tr></tbody></table> Anestetico soluzione <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-Aminobenzoic di etile (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> 0,7 g / l di sodio bicarbonato </td></tr><tr><td colspan="2"> Sciogliere in Amquel trattati con acqua </td></tr><tr><td colspan="2"> Fai fresca settimanale </td></tr></tbody></table> Progesterone scorte <table border="0"><tbody><tr><td> Progesterone 10 mM (Sigma P-0130) in 100% etanolo </td></tr><tr><td> Diluire a 1 mm di EtOH 100% per uno stock 500x / soluzione di lavoro </td></tr><tr><td> Conservare a -20 ° C </td></tr></tbody></table> Coloranti vitali (modificato da Heasman et al., 1991) <table border="0"><tbody><tr><td> Blu: 0,1% Nilo Azzurro A </td><td> (Aldrich 121479-5G), </td></tr><tr><td> Rosso: 0,25% Rosso neutro </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Marrone: 1% Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Verde (80 microlitri blu + 80 microlitri marrone), </td></tr><tr><td colspan="2"> Mauve (80 microlitri blu + 80 rosso microlitri). </td></tr><tr><td colspan="2"> Un colore sesto, arancione (80 + 80 microlitri rosso bruno microlitri), possono essere utilizzati, ma è spesso difficile da distinguere da marrone. </td></tr></tbody></table> Gli stock di blu, rosso e Brown sono preparati in acqua deionizzata a 50 ml provette, incubate per 20 minuti con dondolo e filato in una centrifuga clinica. I surnatanti sono aliquotted in provette da microcentrifuga e conservati a -20 ° C.

fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method

Studiare il contributo di molecole ereditato dalla madre di vertebrati sviluppo precoce è spesso ostacolata dal tempo e la spesa necessaria per generare animali materno-effetto mutante. Inoltre, molte delle tecniche di iperespressione o inibire la funzione dei geni negli organismi come Xenopus zebrafish e non riescono a bersaglio sufficientemente critico le vie di segnalazione della madre, come il segnale Wnt. In Xenopus, manipolando la funzione dei geni negli ovociti in coltura e la loro successiva concimazione può migliorare questi problemi in una certa misura. Ovociti vengono manualmente defolliculated dal tessuto del donatore ovaio, iniettati o trattati in cultura come desiderato, quindi stimolati con progesterone per indurre la maturazione. Successivamente, gli ovociti vengono introdotti nella cavità del corpo di una rana ospitare l&#39;ovulazione femminile, dopo di che verrà traslocato attraverso ovidotto del padrone di casa ed acquisire le modifiche e cappotti gelatina necessaria per la fecondazione. Gli embrioni risultanti possono essere elevato alla scena desiderata e analizzati gli effetti di eventuali perturbazioni sperimentale. L&#39;host di trasferimento metodo è stato molto efficace nello scoprire i meccanismi fondamentali dello sviluppo precoce e consente una vasta gamma di possibilità di sperimentazione non disponibile in qualsiasi altro organismo modello vertebrato.

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Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedura per la concimazione<em&gt; Ovociti di Xenopus</em&gt; Con il metodo del trasferimento di accoglienza.

Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

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