Name: fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method
Uploaded: 2010-11-02T17:00:00
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Los autores desean expresar su agradecimiento miembros del laboratorio de Houston para la lectura crítica del manuscrito. La investigación es financiada por los Institutos Nacionales de Salud (GM083999) otorgó a DWH

1. La extirpación quirúrgica de tejido ovárico <ol class="lalpha"><li> Preparar un nuevo lote de medio de cultivo de ovocitos (OCM; Materiales), entre 400-800 ml, dependiendo del tamaño del experimento. Ajustar el pH a 7,6-7,8, hasta que el rojo fenol se vuelve un color rojo oscuro (seis o más gotas de NaOH 5 N). Vierta una pequeña cantidad para comprobar el pH en un tubo separado desde el electrodo de pH pueden contaminar los medios de comunicación. OCM deben ser almacenados a 18 º C y utilizarse dentro de un...

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	<li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+in+vitro:+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis.">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li><li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos.">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li><li>Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axis+and+germ+line+deficiencies+caused+by+u.v+irradiation+of+Xenopus+oocytes+cultured+in+vitro.">Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro.</a> Development. 100, 735-743 (1987).</li><li>Houston, D. W., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+Xdazl,+a+germ+plasm-localized+RNA,+in+the+differentiation+of+primordial+germ+cells+in+Xenopus.">A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus.</a> Development. 127, 447-456 (2000).</li><li>Mir, A., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+mother+can+help:+studying+maternal+Wnt+signaling+by+anti-sense-mediated+depletion+of+maternal+mRNAs+and+the+host+transfer+technique.">How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique.</a> Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).</li><li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Embryology: Techniques and procedures. , (1962).</li><li>Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+physiological+maturation+in+Rana+pipiens+oocytes+removed+from+their+ovarian+follicles.">In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles.</a> Dev Biol. 17, 627-643 (1968).</li><li>Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+and+oocyte+isolation.">Oogenesis and oocyte isolation.</a> Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).</li><li>Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability,+toxicity+and+effectiveness+of+unmodified+and+phosphorothioate+antisense+oligodeoxynucleotides+in+Xenopus+oocytes+and+embryos.">The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos.</a> Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).</li><li>Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+beta-catenin+establishes+a+'dorsal+signal'+in+early+Xenopus+embryos.">Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos.</a> Development. 122, 2987-2996 (1996).</li><li>Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos.">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li><li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+in+Xenopus+embryos:+an+antisense+approach..">Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach..</a> A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. , 341-354 (1998).</li></ol>

Un éxito de la transferencia dará lugar a la fecundación y la división normal de&gt; 50% de los ovocitos (Figura 3). Generalmente entre 30-60% de los ovocitos transferidos sobreviven más allá de las etapas Néurula. Por lo general, la transferencia de ovocitos desde 75 hasta 150 por grupo experimental, que dará embriones suficiente para varios tipos de análisis (in situ, RT-PCR), así como visualizar el fenotipo. La implantación de ovocitos mucho más no parece aumentar considerablemente el rendimiento. Además...

Soluciones y recetas: OCM (ovocitos medio de cultivo modificado a partir de Wylie et al, 1996). <table border="0"><tbody><tr><td> 70% L-15 de Leibovitz medio (que contiene L-glutamina) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0,4 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA, fracción V) </td><td> (Sigma A-9418-50 g) </td></tr><tr><td> 1x penicilina-estreptomicina </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajustar el pH a 7,6-7,8 con NaOH 5 N </td></tr><tr><td colspan="2"> Hacer nuevas tiendas cada semana, a 18 ° C. </td></tr></tbody></table> 10X MMR (solución modificada de Marc Ringer;. Zuck et al, 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> 1M NaCl </td></tr><tr><td> 20 mM KCl </td></tr><tr><td> 20 mM de CaCl2 </td></tr><tr><td> 10 mM de MgCl 2 </td></tr><tr><td> 150 mM HEPES </td></tr><tr><td> ajustar el pH a 7,6-7,8 </td></tr><tr><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr></tbody></table> Solución anestésica <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-aminobenzoico éster etílico del ácido (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> 0,7 g / L de bicarbonato de sodio </td></tr><tr><td colspan="2"> Disolver en agua tratada con Amquel </td></tr><tr><td colspan="2"> Hacer fresco por semana </td></tr></tbody></table> Las poblaciones de progesterona <table border="0"><tbody><tr><td> 10 mM de progesterona (Sigma P-0130) en el 100% de etanol </td></tr><tr><td> Diluir a 1 mM en EtOH al 100% de una población 500 veces / solución de trabajo </td></tr><tr><td> Almacenar a -20 ° C </td></tr></tbody></table> Colorantes vitales (modificado de Heasman et al., 1991) <table border="0"><tbody><tr><td> Azul: 0,1% del Nilo Azul A </td><td> (Aldrich 121479-5G), </td></tr><tr><td> Red: Red Neutral 0,25% </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Brown: 1% Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Verde (80 azul l + 80 l marrón), </td></tr><tr><td colspan="2"> Malva (80 + 80 l azul rojo l). </td></tr><tr><td colspan="2"> Un color sexto, Orange (80 l rojo + 80 l marrón), también se puede utilizar, pero es a menudo difícil de distinguir de color marrón. </td></tr></tbody></table> Las existencias de azul, rojo y marrón se preparan en agua desionizada en tubos de 50 ml, se incubó durante 20 minutos con la oscilación y la hace girar en una centrífuga clínica. Los sobrenadantes se alícuotas en tubos de microcentrífuga y se almacenan a -20 ° C.

fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method

Estudiar la contribución de las moléculas de herencia materna a la vertebración de desarrollo temprano a menudo se ve obstaculizada por el tiempo y los gastos necesarios para generar animales de la madre y el efecto mutante. Además, muchas de las técnicas para sobreexpresar o inhiben la función de genes en organismos tales como Xenopus y pez cebra no objetivo suficientemente crítica materna vías de señalización, como la señalización de Wnt. En Xenopus, la manipulación de la función de genes en ovocitos cultivados y su posterior fertilización puede mejorar estos problemas hasta cierto punto. Los ovocitos son manualmente defolliculated de tejido de un donante de ovario, inyectado o tratado en la cultura como se desee, y luego estimulados con progesterona para inducir la maduración. A continuación, los ovocitos se introducen en la cavidad del cuerpo de una rana anfitrión ovulación femenina, con lo cual se trasladaron a través del oviducto del anfitrión y adquirir las modificaciones y abrigos de gelatina necesaria para la fecundación. Los embriones resultantes se puede elevar a la fase deseada y se analizaron los efectos de cualquier perturbación experimental. Este método de transferencia de acogida ha sido muy eficaz en el descubrimiento de los mecanismos básicos del desarrollo inicial y permite una amplia gama de posibilidades experimentales no están disponibles en cualquier organismo vertebrado otro modelo.

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Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedimiento para la fertilización<em&gt; Oocitos de Xenopus</em&gt; Por el método de transferencia de acogida.

La fertilización de Oocitos de Xenopus Utilizando el método de transferencia de acogida

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

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Biology

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

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