Name: identification of growth inhibition phenotypes induced by expression of bacterial type iii effectors in yeast
Uploaded: 2010-03-30T16:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela Fundação Ciência Israel.

I. Projetar um sistema de expressão de levedura para Effectors Tipo III Calibrar um sistema de levedura apropriadas para a expressão do tipo III efetoras (s) de interesse é uma tarefa importante e pode exigir algumas tentativas e erros. Fatores de maior relevância que devem ser considerados e otimizados ao projetar um sistema desse tipo são: 1) o promotor de condução expressão do efetor (s), 2) o número de cópias do gene efetor, 3) a tag epítopo usado para verificar a expressão da ...

<ol>
	<li>Siggers, K. A., Lesser, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae:+a+versatile+model+system+for+the+identification+and+characterization+of+bacterial+virulence+proteins.">The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins.</a> Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).</li><li>Parsons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways.">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li><li>Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+type+III+secretion+system+effector+repertoire+reveals+several+effectors+that+are+deleterious+when+expressed+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).</li><li>Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+study+bacterial+effectors.">Yeast as a tool to study bacterial effectors.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).</li><li>Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+yeast+screen+to+identify+pathogenic+bacterial+proteins.">A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins.</a> PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).</li><li>Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+role+of+the+CopN+protein+in+Chlamydia+pneumoniae+intracellular+growth.">The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth.</a> Nature. 456, 112-115 (2008).</li></ol>

Nesta apresentação, ilustramos como usar o brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae como um sistema heterólogo para a expressão do tipo III bacteriana proteínas efetoras e como identificar efetoras induzida fenótipos inibição do crescimento. Importante, esses fenótipos podem ser utilizados em telas genéticos para identificar os supressores do impacto negativo sobre o crescimento de efetores levedura. Supressores pode representar tanto alvos diretos da efetoras estudadas ou proteínas que participa...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>212750</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Peptone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>211677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>214010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>291940</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast synthetic drop-out medium supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Y2001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-galactose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G0750</td>
<td>&gt;99%; &lt;0.1% glucose</td>
</tr>
<tr>
<td>D-raffinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R0250</td>
<td>&gt;98%</td>
</tr>
<tr>
<td>L-leucine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uracil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>U0750</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tryptophan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-histidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H6034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA, single stranded, from salmon testes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D7656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5879</td>
<td>Desiccate</td>
</tr>
<tr>
<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H1758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4338</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lithium acetate (LiAc)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4958</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris (base)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T. Baker</td>
<td>4109-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5516</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B6131</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dodecyl sulfate sodium salt (SDS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>8.22050.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430052</td>
<td>Sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>67.742</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inoculation loop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z643009</td>
<td>Sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH indicator strip, pH 6.5-10.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>1.09543.0001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

identification of growth inhibition phenotypes induced by expression of bacterial type iii effectors in yeast

Muitas bactérias Gram-negativas patogénicas usam um sistema de secreção do tipo III para translocar um conjunto de proteínas efetoras para o citosol das células do hospedeiro. Dentro da célula, effectors tipo III subverter processos de celular do hospedeiro para suprimir a resposta imunológica e promover o crescimento de patógenos. Efetores tipo numerosos III de plantas e animais patógenos bacterianos foram identificados até o momento, mas apenas alguns deles estão bem caracterizadas. Compreender as funções destes efetores tem sido prejudicada por uma combinação de redundância funcional no repertório efetoras de uma cepa bacteriana dadas, os efeitos sutis que podem exercer para aumentar a virulência, os papéis que são, possivelmente, específicos para estágios determinada infecção, e dificuldades no geneticamente manipulação de certos patógenos. Expressão de efetores tipo III na levedura de brotamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Pode permitir contornar estas limitações e ajuda para a caracterização funcional de proteínas efetoras. Porque effectors tipo III muitas vezes alvo de processos celulares que são conservados entre leveduras e outros eucariotos, sua expressão em levedura pode resultar em fenótipos inibição de crescimento que pode ser explorada para elucidar funções efetoras e metas. Vantagens adicionais ao uso de fermento para estudos funcionais de efetores bacteriana incluem sua docilidade genético, informações sobre as funções previstas da grande maioria de suas ORFs, e disponibilidade de várias ferramentas e recursos para experiências tanto do genoma e em pequena escala. Aqui vamos discutir os fatores críticos para a concepção de um sistema de levedura para a expressão de proteínas do tipo bacteriana III efetoras. Estes incluem um promotor apropriado para dirigir a expressão do gene efetor (s) de interesse, o número de cópias do gene efetor, o tag epítopo usado para verificar a expressão da proteína, ea cepa de levedura. Apresentamos os procedimentos de induzir a expressão de efetores em leveduras e verificar a sua expressão por immunoblotting. Além disso, descrevemos um ensaio de spotting em placas de agar para a identificação de fenótipos efetoras induzida por inibição do crescimento. O uso deste protocolo pode ser prorrogado para o estudo de fatores de patogenicidade entregue na célula hospedeira por qualquer patógeno e mecanismo de translocação.

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Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a expressão de efetores tipo bacteriana III em levedura ea identificação de fenótipos efetoras induzida por inibição do crescimento. Esses fenótipos podem ser posteriormente explorada para elucidar funções efetoras e metas.

Identificação de fenótipos inibição do crescimento induzido pela expressão de Effectors Tipo III bacteriana em Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Biologia

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expressão de proteínas recombinantes em levedura metilotróficas Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Entrega bacteriana de RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Ensaios de crescimento para avaliar a toxicidade poliglutamina em Levedura

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Quantificação de Orofacial nos fenótipos<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Preciso, elevado-throughput análise do crescimento bacteriano

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Signaling

Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...