Name: application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a dna repair protein
Uploaded: 2010-03-31T17:00:00
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Diese Arbeit wurde durch einen NSF CAREER Award (MMH), ein Barry M. Goldwater Stipendium (FNB) und eine ASBMB Undergraduate Research Award (CWD) unterstützt. Der Klon für die Überexpression von PBP wurde freundlicherweise von Dr. Martin Webb (MRC, UK) zur Verfügung gestellt.

A. Messung der MSH2-MSH6 DNA Binding Kinetics 1. Probenvorbereitung für die MSH2-MSH6 DNA Bindungskinetik Experiment Vorbereitung der Reagenzien für einen Fluoreszenz-basierten kinetischen DNA-Bindung Experiment auf einer stopped-flow ist ähnlich wie bei einem Gleichgewicht Experiment auf einem Fluorometer. In der Tat Gleichgewicht verbindliche Analyse sollte zuerst durchgeführt werden, um die Dissoziationskonstante (K D) für die Interaktion z...

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	<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transient-state+kinetics.">Advances in transient-state kinetics.</a> Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).</li><li>Johnson, K. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Kinetic analysis of macromolecules. , (2003).</li><li>Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+mismatch+repair+protein+MutS+and+its+complex+with+a+substrate+DNA.">Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA.</a> Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).</li><li>Lamers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+DNA+mismatch+repair+protein+MutS+binding+to+a+G+x+T+mismatch.">The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch.</a> Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).</li><li>Warren, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+MutSalpha+DNA+lesion+recognition+complex.">Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex.</a> Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).</li><li>Kunkel, T. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).</li><li>Jiricny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+mismatch-repair+system.">The multifaceted mismatch-repair system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).</li><li>Hsieh, P., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+mismatch+repair:+Molecular+mechanism,+cancer,+and+ageing.">DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).</li><li>Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+nucleotides+on+MutS-DNA+binding+kinetics+clarify+the+role+of+MutS+ATPase+activity+in+mismatch+repair.">The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair.</a> J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).</li><li>Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Msh2+and+Msh6+subunits+to+the+asymmetric+ATPase+and+DNA+mismatch+binding+activities+of+Saccharomyces+cerevisiae+Msh2-Msh6+mismatch+repair+protein.">Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein.</a> DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).</li><li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+recognition-coupled+stabilization+of+Msh2-Msh6+in+an+ATP-bound+state+at+the+initiation+of+DNA+repair.">Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair.</a> Biochemistry. 42 (25), 7682-7693 (2003).</li><li>Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction+and+analysis+of+eukaryotic+multiprotein+complexes+in+Escherichia+coli+using+a+dual-vector+strategy.">Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy.</a> Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).</li><li>Zhai, J., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.+cerevisiae+Msh2-Msh6+DNA+binding+kinetics+reveal+a+mechanism+of+targeting+sites+for+DNA+mismatch+repair.">S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct,+real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase.">Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li><li>Brune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inorganic+phosphate+interaction+with+phosphate+binding+protein+from+Escherichia+coli.">Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli.</a> Biochemistry. 37 (29), 10370-10380 (1998).</li><li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+ATP+binding+and+hydrolysis+activity+of+the+Thermus+aquaticus+MutS+dimer+is+key+to+modulation+of+its+interactions+with+mismatched+DNA.">Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA.</a> Biochemistry. 43 (41), 13115-13128 (2004).</li><li>Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+mismatch+recognition+complex+hMSH2-hMSH6+functions+as+a+novel+molecular+switch.">The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch.</a> Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).</li><li>Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Msh6+ATPase+activity+by+mispaired+DNA+induces+a+Msh2(ATP)-Msh6(ATP)+state+capable+of+hydrolysis-independent+movement+along+DNA.">Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA.</a> Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).</li></ol>

Das Beispiel eines DNA-Mismatch-binding protein hier beschriebenen veranschaulicht die Leistungsfähigkeit und den Nutzen von transient kinetische Methoden zur Erforschung der Mechanismen von biologischen Molekülen. Stopped-Flow-Messungen an den einzelnen Umsatz Zeitskala der eindeutige Beweis für eine schnelle und spezifische Bindung von MSH2-MSH6 Protein zu einem übereinstimmenden Basenpaar und die Bildung eines langlebigen Protein X DNA-Komplex in der Reaktion 9. Des Weiteren hat die Stopped-Flow-(und Q...

<table border="1"><tr><td> DNA-Namen </td><td> Reihenfolge </td></tr><tr><td> 37 G </td><td> 5&#39;-ATT TCC TTC AGC AGA TAT G TA CCA TAC TGA TTC ACA T -3 &#39; </td></tr><tr><td> 37 T (2-Ap) </td><td> 5&#39;-ATG TGA ATC AGT ATG GTA T Ap T ATC TGC TGA AGG AAA T -3 &#39; </td></tr><tr><td> 37 T </td><td> 5&#39;-ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3 &#39; </td></tr></table>

application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a dna repair protein

Transient kinetische Analyse ist für das Verständnis der Funktionsweise von biologischen Makromolekülen unverzichtbar, da dieser Ansatz liefert mechanistische Informationen einschließlich der aktiven Seite Konzentrationen und intrinsischen Geschwindigkeitskonstanten, die makromolekulare Funktion zu regieren. Im Falle von Enzymen, z. B. zu identifizieren vorübergehend oder pre-steady state Messungen und Charakterisierung von einzelnen Veranstaltungen in den Reaktionsweg, während steady state Messungen nur Gesamtausbeute katalytische Effizienz und Spezifität. Einzelne Ereignisse wie Protein-Protein-oder Protein-Ligand-Wechselwirkungen und geschwindigkeitsbestimmenden Konformationsänderungen treten häufig in den Millisekundenbereich und kann direkt durch Stopped-Flow-und chemisch-Quench-Flow-Verfahren gemessen werden. Da ein optisches Signal, wie Fluoreszenz, stopped-flow dient als leistungsfähige und leicht zugängliche Tool zur Überwachung Reaktion Fortschritt von Substratbindung an Produkt-Release und katalytische Umsatz 1,2. Hier berichten wir über Anwendung der Stopped-Flow-Kinetik der Wirkmechanismus von MSH2-MSH6, einer eukaryotischen DNA-Reparatur-Protein, das Basenpaar-Fehlpaarungen und Einfügen / Löschen Schleifen in DNA und Signale Mismatch-Reparatur (MMR) 3-5 erkennt Sonde. Dabei hilft MSH2-MSH6 erhöht die Genauigkeit der DNA-Replikation von drei Größenordnungen (Fehlerhäufigkeit sinkt von ~ 10 -6 bis 10 -9 Basen) und damit zu bewahren genomischen Integrität. Es überrascht nicht, ist defekt menschlichen MSH2-MSH6 Funktion mit hereditären nicht-polypösen Darmkrebs und anderen Krebsarten sporadisch 6-8 verbunden. Um den Wirkmechanismus dieser kritischen DNA metabolischen Protein zu verstehen, sind wir die Erforschung der Dynamik der MSH2-MSH6 Interaktion mit nicht übereinstimmenden DNA sowie die ATPase-Aktivität, die Kraftstoffe seine Aktionen in MMR. T mismatch und Überwachung der daraus resultierende Anstieg in 2-Amino-Fluoreszenz in Echtzeit: DNA-Bindung wird durch rasches Mischen MSH2-MSH6 mit DNA mit einem 2-Amino (2-Ap) Fluorophor benachbart zu einem G gemessen. T (2-Ap) Mismatch-Komplex mit unmarkierten Falle DNA und Überwachung Abnahme der Fluoreszenz im Laufe der Zeit 9: DNA Dissoziation wird durch Mischen von vorgeformten MSH2-MSH6 G gemessen. Pre-Steady-State-ATPase Kinetik werden durch die Veränderung der Fluoreszenz von 7-Diethylamino-3-((((2-maleimidyl) ethyl) amino) carbonyl) Cumarin)-markiertem Phosphat Binding Protein (MDCC-PBP) auf Bindung von Phosphat (gemessen Pi) von MSH2-MSH6 folgenden ATP-Hydrolyse 9,10 freigegeben. Die Daten zeigen eine schnelle Bindung von MSH2-MSH6 eine G: T Mismatch und die Bildung eines langlebigen MSH2-MSH6 G: T-Komplex, was wiederum zu einer Unterdrückung der ATP-Hydrolyse und die Stabilisierung des Proteins in einem ATP-gebundenen Form . Die Reaktionskinetik klare Unterstützung für die Hypothese, dass ATP-gebundenen MSH2-MSH6 Signale DNA-Reparatur auf die Bindung einer unpassenden Basenpaar in der Doppelhelix. F. Noah Biro und Jie Zhai trugen zu diesem Papier ebenso.

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Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

MSH2-MSH6 ist verantwortlich für die Initiierung Reparatur der Replikation Fehler bei der DNA. Hier präsentieren wir eine transiente Kinetik Ansatz zum Verständnis, wie diese kritische Protein funktioniert. Der Bericht zeigt, stopped-flow Experimente zur Messung der gekoppelten DNA-Bindung und ATPase-Kinetik zugrunde liegenden MSH2-MSH6 Wirkmechanismus in der DNA-Reparatur.

Die Anwendung der Stopped-Flow-Kinetics Methoden der Wirkmechanismus eines DNA-Repair Protein Untersuchen

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic ...

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Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

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Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

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