Name: application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a dna repair protein
Uploaded: 2010-03-31T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פרס קריירה NSF (מממ), מ &#39;בארי גולדווטר מלגה (FNB) וכן בפרס ASBMB מחקר לתואר ראשון (CWD). שיבוט ביטוי יתר של PBP סופק באדיבות על ידי ד&quot;ר מרטין ווב (MRC, בריטניה).

א מדידה של קינטיקס עקידת Msh2 MSH6-DNA 1. לדוגמה לקראת הניסוי Msh2-DNA MSH6 קינטיקה מחייב הכנה של ריאגנטים לניסוי הקרינה מבוסס DNA הקינטית מחייב זרימה עצרו דומה לניסוי שיווי משקל על fluorometer. אכן מחייב ניתוח שיו...

<ol>
	<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transient-state+kinetics.">Advances in transient-state kinetics.</a> Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).</li><li>Johnson, K. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Kinetic analysis of macromolecules. , (2003).</li><li>Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+mismatch+repair+protein+MutS+and+its+complex+with+a+substrate+DNA.">Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA.</a> Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).</li><li>Lamers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+DNA+mismatch+repair+protein+MutS+binding+to+a+G+x+T+mismatch.">The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch.</a> Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).</li><li>Warren, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+MutSalpha+DNA+lesion+recognition+complex.">Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex.</a> Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).</li><li>Kunkel, T. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).</li><li>Jiricny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+mismatch-repair+system.">The multifaceted mismatch-repair system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).</li><li>Hsieh, P., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+mismatch+repair:+Molecular+mechanism,+cancer,+and+ageing.">DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).</li><li>Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+nucleotides+on+MutS-DNA+binding+kinetics+clarify+the+role+of+MutS+ATPase+activity+in+mismatch+repair.">The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair.</a> J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).</li><li>Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Msh2+and+Msh6+subunits+to+the+asymmetric+ATPase+and+DNA+mismatch+binding+activities+of+Saccharomyces+cerevisiae+Msh2-Msh6+mismatch+repair+protein.">Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein.</a> DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).</li><li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+recognition-coupled+stabilization+of+Msh2-Msh6+in+an+ATP-bound+state+at+the+initiation+of+DNA+repair.">Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair.</a> Biochemistry. 42 (25), 7682-7693 (2003).</li><li>Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction+and+analysis+of+eukaryotic+multiprotein+complexes+in+Escherichia+coli+using+a+dual-vector+strategy.">Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy.</a> Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).</li><li>Zhai, J., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.+cerevisiae+Msh2-Msh6+DNA+binding+kinetics+reveal+a+mechanism+of+targeting+sites+for+DNA+mismatch+repair.">S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct,+real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase.">Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li><li>Brune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inorganic+phosphate+interaction+with+phosphate+binding+protein+from+Escherichia+coli.">Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli.</a> Biochemistry. 37 (29), 10370-10380 (1998).</li><li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+ATP+binding+and+hydrolysis+activity+of+the+Thermus+aquaticus+MutS+dimer+is+key+to+modulation+of+its+interactions+with+mismatched+DNA.">Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA.</a> Biochemistry. 43 (41), 13115-13128 (2004).</li><li>Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+mismatch+recognition+complex+hMSH2-hMSH6+functions+as+a+novel+molecular+switch.">The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch.</a> Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).</li><li>Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Msh6+ATPase+activity+by+mispaired+DNA+induces+a+Msh2(ATP)-Msh6(ATP)+state+capable+of+hydrolysis-independent+movement+along+DNA.">Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA.</a> Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).</li></ol>

הדוגמה של חלבון ה-DNA מחייבת התאמה המתואר כאן מדגים את הכוח ואת השירות של שיטות הקינטית חולף לחקר המנגנונים של מולקולות ביולוגיות. הפסיקה זרימת מדידות על היקף מחזור אחד זמן סיפקו ראיות חד משמעיות עבור מחייב מהירה מסוים של חלבון Msh2-MSH6 לזוג בסיס תואמים היווצרות קומפלקס ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> דנ&quot;א שם </td><td> רצף </td></tr><tr><td> 37 G </td><td> 5&#39;-ATT TCC TTC AGC AGA תאת G ת&quot;א, המרכז לאמנות עכשווית TAC TGA TTC ACA T -3 &quot; </td></tr><tr><td> 37 T (2-AP) </td><td> 5&#39;-ATG TGA ATC AGT ATG GTA T Ap T ATC TGC TGA AGG AAA T -3 &quot; </td></tr><tr><td> 37 T </td><td> 5&#39;-ATG TGA ATC AGT ATG GTA T ATC T TGC TGA AGG AAA -3 T &quot; </td></tr></table>

application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a dna repair protein

ניתוח חלוף הקינטית היא הכרחית להבנת פעולתו של מקרומולקולות ביולוגיות, שכן גישה זו מניבה מידע מכניסטית כולל ריכוזי אתר פעיל וקבועים שיעור מהותי השולטים פונקציה macromolecular. במקרה של אנזימים, למשל, מדידות מצב חולף או קבוע מראש לזהות ולאפיין אירועים בודדים במסלול התגובה, ואילו מדידות מצב יציב רק תשואה יעילות קטליטית סגוליות הכוללת. אירועים בודדים כגון חלבונים או חלבונים אינטראקציות ליגנד וקצב הגבלת שינויי קונפורמציה לעתים קרובות להתרחש זמנים אלפית השנייה, וניתן למדוד ישירות על ידי זרימה עצר כימי להרוות שיטות הזרימה. בהינתן האות האופטי כגון פלואורסצנטי, הפסיקה זרימת משמש ככלי רב עוצמה ונגיש להתקדמות ניטור התגובה מן המצע מחייב לשחרר את המוצר 1,2 מחזור קטליטי. כאן אנו מדווחים יישום הפסיקה זרימת קינטיקה לחקור את מנגנון הפעולה של Msh2-MSH6, דנ&quot;א אוקריוטים לתקן החלבון מזהה בסיס חוסר התאמה זוג והחדרת / מחיקה לולאות ב-DNA אותות אי התאמה לתקן (MMR) 3-5. בעשותו כן, Msh2-MSH6 מגדילה את הדיוק של שכפול ה-DNA על ידי שלושה סדרי גודל (תדר שגיאה יורדת מ ~ 10 -6 to10 -9 בסיסים), ובכך מסייע לשמור על שלמות הגנומי. באופן לא מפתיע, תפקוד לקוי האדם Msh2-MSH6 קשורה לסרטן שאינן polyposis תורשתית המעי הגס וסוגי סרטן אחרים סדיר 6-8. כדי להבין את מנגנון הפעולה של חלבון ה-DNA הזה קריטי מטבולית, אנו לחקור את הדינמיקה של האינטראקציה Msh2-MSH6 עם דנ&quot;א תואמים, כמו גם את פעילות ATPase כי דלקים פעולותיה MMR. ה-DNA מחייבת נמדדת במהירות ערבוב Msh2-MSH6 עם ה-DNA המכיל 2-aminopurine (2-AP) fluorophore הסמוכים G: T התאמה וניטור הגידול וכתוצאה מכך הקרינה 2-aminopurine בזמן אמת. ה-DNA דיסוציאציה נמדדת על ידי ערבוב מראש יצרו Msh2-MSH6 G: T (2-AP) מורכב התאמה עם DNA מלכודת ללא תווית וירידה ניטור הקרינה במשך הזמן 9. טרום יציב ATPase קינטיקה המדינה נמדדים על פי השינוי פלואורסצנציה של 7-diethylamino-3-((((2-maleimidyl) אתיל) אמינו) קרבוניל) coumarin) שכותרתו חלבון פוספט הכבילה (MDCC-PBP) על פוספט מחייב ( Pi) שפורסמו על ידי Msh2-MSH6 הבאים הידרוליזה ATP 9,10. מהנתונים עולה מחייב המהירה של Msh2-MSH6 ל-G: התאמה T היווצרות של חיים ארוכים Msh2 MSH6-G: T מורכבות, שבתורה גוררת בדיכוי הידרוליזה של ATP וייצוב של החלבון בצורת ATP הנכנס . קינטיקה התגובה לספק תמיכה ברורה ההשערה כי ה-ATP, מחויב Msh2-MSH6 אותות תיקון DNA על הכריכה זוג בסיס תואמים בתוך הסליל הכפול. פ &#39;נח בירו ו Jie Zhai תרמו במאמר זה שווה.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein at JoVE.com

Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

Msh2-MSH6 אחראית ליזום תיקון של טעויות שכפול ה-DNA. כאן אנו מציגים גישה קינטיקה חולף לקראת הבנה איך זה עובד חלבון קריטי. הדו&quot;ח ממחיש הפסיקה זרימת ניסויים למדידת מחייב DNA מצמידים ו קינטיקה ATPase הבסיסית Msh2-MSH6 מנגנון הפעולה של תיקון דנ&quot;א.

יישום הופסק זרימה שיטות קינטיקס לחקור את מנגנון הפעולה של חלבון תיקון DNA

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

DNA Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

יישום של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay הגנת ה-DNA כדי להמחיש את מאפייני גישור לחץ של חלבון DPS

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

פיתוח של מעכבי חלבונים אינטראקציות דרך להחליף: בקשה לעיצוב ומעכבי CDK התחרותי הפיתוח ללא ATP

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...