Name: application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a dna repair protein
Uploaded: 2010-03-31T17:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da un premio CARRIERA NSF (MMH), una borsa di studio Barry M. Goldwater (FNB) e un premio ASBMB Undergraduate Research (CWD). Il clone di sovra-espressione di PBP è stato gentilmente fornito dal Dr. Martin Webb (MRC, UK).

A. Misura della MSH2-MSH6 DNA Cinetica Binding 1. Preparazione del campione per il MSH2-MSH6 DNA esperimento di cinetica di binding Preparazione di reagenti per una fluorescenza basato esperimento DNA cinetica vincolante per uno stopped-flow è simile a quello per un esperimento di equilibrio su un fluorimetro. In effetti l&#39;analisi di equilibrio vincolante dovrebbe essere eseguito prima a stimare la costante di dissociazione (K D) per l&#39;int...

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	<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transient-state+kinetics.">Advances in transient-state kinetics.</a> Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).</li><li>Johnson, K. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Kinetic analysis of macromolecules. , (2003).</li><li>Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+mismatch+repair+protein+MutS+and+its+complex+with+a+substrate+DNA.">Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA.</a> Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).</li><li>Lamers, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.+cerevisiae+Msh2-Msh6+DNA+binding+kinetics+reveal+a+mechanism+of+targeting+sites+for+DNA+mismatch+repair.">S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. 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D., D, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Msh6+ATPase+activity+by+mispaired+DNA+induces+a+Msh2(ATP)-Msh6(ATP)+state+capable+of+hydrolysis-independent+movement+along+DNA.">Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA.</a> Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).</li></ol>

L&#39;esempio di una proteina di legame al DNA mancata corrispondenza qui descritto illustra la potenza e l&#39;utilità di transitori metodi cinetici per lo studio dei meccanismi di molecole biologiche. Stopped-flow misura sulla scala singolo momento fatturato fornito prove inequivocabili per il legame rapido e specifico di proteine ​​MSH2-MSH6 ad una coppia di basi non corrispondenti e la formazione di una lunga durata complesso proteina X del DNA nella reazione 9. Inoltre, stopped-flow (e dissetare-flo...

<table border="1"><tr><td> DNA nome </td><td> Sequenza </td></tr><tr><td> 37 g </td><td> 5&#39;-ATT TCC TTC AGC AGA TAT G TA CCA TAC TGA TTC ACA T -3 &#39; </td></tr><tr><td> 37 t (2-Ap) </td><td> 5&#39;-ATG TGA ATC AGT ATG GTA T Ap T ATC TGC TGA AGG AAA T -3 &#39; </td></tr><tr><td> 37 T </td><td> 5&#39;-ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA -3 T &#39; </td></tr></table>

application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a dna repair protein

Transitori analisi cinetica è indispensabile per comprendere il funzionamento delle macromolecole biologiche, dal momento che questo approccio produce informazioni meccanicistico, inclusa la concentrazione sito attivo e costanti di velocità intrinseche che regolano la funzione macromolecolari. In caso di enzimi, per esempio, le misurazioni stato transitorio o pre-steady identificare e caratterizzare gli eventi individuali nel percorso di reazione, mentre le misurazioni stato stazionario solo resa complessiva efficienza catalitica e specificità. Singoli eventi, come proteina-proteina o proteina-ligando interazioni e rate-limiting cambiamenti conformazionali spesso si verificano in tempi millisecondo, e può essere misurato direttamente per stopped-flow e chimico-tempra metodi di flusso. Dato un segnale ottico come fluorescenza, stopped-flow è uno strumento potente ed accessibile per il progresso reazione monitoraggio da substrato vincolante al rilascio del prodotto e fatturato 1,2 catalitica. Qui riportiamo applicazione di stopped-flow cinetica per sondare il meccanismo d&#39;azione di MSH2-MSH6, una proteina eucariotica riparazione del DNA che riconosce base-pair mismatch e inserzione / delezione loop nel DNA e mancata corrispondenza dei segnali di riparazione (MMR) 3-5. In tal modo, MSH2-MSH6 aumenta l&#39;accuratezza della replicazione del DNA da tre ordini di grandezza (frequenza di errore si riduce da ~ 10 -6 a 10 -9 basi), e quindi aiuta a preservare l&#39;integrità genomica. Non sorprende, difettosi umano MSH2-MSH6 funzione è ereditario non associato a poliposi-cancro del colon e altri tumori sporadici 6-8. Al fine di comprendere il meccanismo d&#39;azione di questa proteina fondamentale del metabolismo del DNA, stiamo sondando le dinamiche di MSH2-MSH6 interazione con il DNA non corrispondenti così come l&#39;attività ATPasi che alimenta le sue azioni in MMR. Legame del DNA viene misurata mediante una rapida miscelazione MSH2-MSH6 con il DNA che contiene un 2-aminopurine (2-Ap) fluoroforo adiacente ad un G: T mancata corrispondenza e di monitoraggio il conseguente aumento della 2-aminopurine fluorescenza in tempo reale. DNA dissociazione si misura con la miscelazione pre-formate MSH2-MSH6 G: T (2-Ap) complesso di mancata corrispondenza con il DNA trappola senza etichetta e la diminuzione di monitoraggio della fluorescenza nel tempo 9. Pre-costante cinetica ATPasi statali sono misurati con la variazione di fluorescenza del 7-dietilammino-3-((((2-maleimidyl) etil) ammino) carbonile) cumarina)-etichettati fosfato Binding Protein (MDCC-PBP) su fosfato di legame ( Pi) pubblicato da MSH2-MSH6 seguenti idrolisi dell&#39;ATP 9,10. I dati rivelano vincolante rapida MSH2-MSH6 ad un G: mancata corrispondenza T e la formazione di una lunga durata MSH2-MSH6 G: T complesso, che a sua volta provoca la soppressione di idrolisi dell&#39;ATP e la stabilizzazione della proteina in un ATP form associato . La cinetica di reazione di fornire un chiaro sostegno per l&#39;ipotesi che l&#39;ATP-bound-MSH2 MSH6 segnali di riparazione del DNA su una coppia di legame non corrispondenti base nella doppia elica. F. Noè Biro e Jie Zhai contribuito a questo documento allo stesso modo.

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Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

MSH2-MSH6 è responsabile per l&#39;avvio di riparazione di errori di replicazione del DNA. Qui vi presentiamo un approccio transitorio cinetica verso la comprensione di come lavora questa proteina critica. Il rapporto illustra stopped-flow esperimenti per misurare il legame del DNA accoppiati e cinetica ATPasi sottostante MSH2-MSH6 meccanismo d&#39;azione nella riparazione del DNA.

Applicazione di metodi Stopped-flow Cinetica per Indagare sulla Meccanismo d&#39;azione di una proteina di riparazione del DNA

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic ...

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