Name: application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a dna repair protein
Uploaded: 2010-03-31T17:00:00
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Este trabalho foi financiado por uma concessão de CARREIRA NSF (MMH), um Barry M. Goldwater bolsa (FNB) e um Prêmio de Pesquisa ASBMB Graduação (CWD). O clone de sobre-expressão do PBP foi gentilmente cedido pelo Dr. Martin Webb (MRC, UK).

A. Medição de MSH2-MSH6 DNA Cinética Binding 1. Preparação de amostras para o ensaio de cinética de MSH2-MSH6 DNA de ligação Preparação de reagentes para uma experiência de DNA por fluorescência baseada cinética de ligação em uma parada de fluxo é semelhante ao de um experimento de equilíbrio em um fluorímetro. Na verdade análise de equilíbrio de ligação deve ser feita primeiro para calcular a constante de dissociação (K D) ...

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	<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transient-state+kinetics.">Advances in transient-state kinetics.</a> Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).</li><li>Johnson, K. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Kinetic analysis of macromolecules. , (2003).</li><li>Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+mismatch+repair+protein+MutS+and+its+complex+with+a+substrate+DNA.">Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA.</a> Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).</li><li>Lamers, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.+cerevisiae+Msh2-Msh6+DNA+binding+kinetics+reveal+a+mechanism+of+targeting+sites+for+DNA+mismatch+repair.">S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct,+real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase.">Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li><li>Brune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inorganic+phosphate+interaction+with+phosphate+binding+protein+from+Escherichia+coli.">Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli.</a> Biochemistry. 37 (29), 10370-10380 (1998).</li><li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+ATP+binding+and+hydrolysis+activity+of+the+Thermus+aquaticus+MutS+dimer+is+key+to+modulation+of+its+interactions+with+mismatched+DNA.">Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA.</a> Biochemistry. 43 (41), 13115-13128 (2004).</li><li>Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+mismatch+recognition+complex+hMSH2-hMSH6+functions+as+a+novel+molecular+switch.">The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch.</a> Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).</li><li>Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Msh6+ATPase+activity+by+mispaired+DNA+induces+a+Msh2(ATP)-Msh6(ATP)+state+capable+of+hydrolysis-independent+movement+along+DNA.">Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA.</a> Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).</li></ol>

O exemplo de uma proteína de ligação incompatibilidade DNA aqui descrita ilustra o poder e utilidade dos métodos transientes cinética para estudar os mecanismos de moléculas biológicas. Stopped-flow medições na escala de volume de negócios único momento, desde evidência inequívoca para a ligação rápida e específica de MSH2-MSH6 proteína para um par de bases incompatíveis e formação de uma vida longa complexo DNA-proteína X na reação 9. Além disso, parou de fluxo (e saciar-flow) análi...

<table border="1"><tr><td> Nome de DNA </td><td> Seqüência </td></tr><tr><td> 37 G </td><td> 5&#39;-ATT TCC TTC AGC AGA TAT G TA CCA TGA TAC TTC ACA -3 T &#39; </td></tr><tr><td> 37 T (2-Ap) </td><td> 5&#39;-ATG TGA ATC AGT ATG GTA T Ap T ATC TGC TGA AGG AAA -3 T &#39; </td></tr><tr><td> 37 T </td><td> 5&#39;-ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG -3 AAA T &#39; </td></tr></table>

application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a dna repair protein

Análise cinética transitória é indispensável para a compreensão do funcionamento de macromoléculas biológicas, uma vez que esta abordagem produz informações mecanicista incluindo concentrações sítio ativo e constantes de velocidade intrínseca que governam a função de macromoléculas. Em caso de enzimas, por exemplo, medições estado transiente ou pré-estável identificar e caracterizar os eventos individuais no caminho da reação, enquanto que as medições estado estacionário só o rendimento global de eficiência catalítica e especificidade. Eventos individuais, como a proteína-proteína ou proteína-ligante interações e limitação de taxa de mudanças conformacionais ocorrem frequentemente na escala de tempo de milissegundos, e pode ser medido diretamente pelo stopped-flow e químico-quench métodos de fluxo. Dado um sinal óptico, tais como fluorescência, stopped-flow serve como uma ferramenta poderosa e acessível para monitorar o progresso reação de substrato de ligação para lançamento do produto e volume de negócios 1,2 catalítico. Aqui, relatamos a aplicação de stopped-flow cinética para investigar o mecanismo de ação de MSH2-MSH6, uma proteína de reparo do DNA eucariótico que reconhece pares de bases das disparidades e de inserção / deleção no DNA loops e reparar os sinais de incompatibilidade (MMR) 3-5. Ao fazer isso, MSH2-MSH6 aumenta a precisão da replicação do DNA por três ordens de magnitude (freqüência de erro diminui de ~ 10 -6 a 10 -9 bases), e assim ajuda a preservar a integridade genômica. Não surpreendentemente, com defeito função MSH2-MSH6 humano é associado com câncer de cólon hereditário não-polipose e outros cânceres esporádicos 6-8. A fim de compreender o mecanismo de ação dessa proteína metabólica crítica DNA, estamos investigando a dinâmica de MSH2-MSH6 interação com DNA incompatíveis, bem como a atividade de ATPase que alimenta suas ações no MMR. DNA de ligação é medida pela rápida mistura MSH2-MSH6 com DNA contendo a 2 aminopurina-(2-Ap) adjacente a um fluoróforo G: T incompatibilidade e acompanhamento do aumento resultante em 2 aminopurina-fluorescência em tempo real. DNA dissociação é medido através da mistura pré-formada MSH2-MSH6 G: T (2-Ap) complexo incompatibilidade com o DNA armadilha sem rótulo e diminuir monitoramento de fluorescência ao longo do tempo 9. Pré-ATPase constante cinética de estado são medidos pela mudança de fluorescência de 7-dietilamino-3-((((2-maleimidyl) etil) amino) carbonil) cumarina) marcado Protein Fosfato Binding (MDCC-PBP) em fosfato de ligação ( Pi) liberado pela MSH2-MSH6 seguintes ATP hidrólise 9,10. Os dados revelam ligação rápida de MSH2-MSH6 para um G: Incompatibilidade de T e formação de uma vida longa MSH2-MSH6 G: T complexo, que resulta na supressão da ATP hidrólise e estabilização da proteína em um formulário de ATP-bound . A cinética da reação assegurar um apoio claro para a hipótese de que o ATP-bound MSH2-MSH6 sinais de reparo de DNA em ligação de um par de bases desiguais em dupla hélice. F. Noah Biro e Jie Zhai contribuíram para este trabalho de forma igual.

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Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

MSH2-MSH6 é responsável por iniciar reparação de erros de replicação de DNA. Aqui nós apresentamos uma abordagem cinética transitória para a compreensão crítica como esta proteína funciona. O relatório ilustra stopped-flow experimentos para medir a ligação DNA acopladas e cinética ATPase subjacente MSH2-MSH6 mecanismo de ação no reparo do DNA.

Aplicação de Métodos Stopped fluxo de Cinética para investigar o mecanismo de ação de uma proteína de reparo do DNA

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic ...

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