Name: application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a dna repair protein
Uploaded: 2010-03-31T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein at JoVE.com

Detta arbete stöddes av en NSF KARRIÄR Award (MMH), en Barry M. Goldwater stipendium (FNB) och en ASBMB Grundutbildning Research Award (CWD). Den klon för över-uttryck av PBP var vänligt tillhandahålls av Dr Martin Webb (MRC, Storbritannien).

A. Mätning av MSH2-Msh6 DNA-bindande Kinetics 1. Provberedning för MSH2-Msh6 DNA-bindande kinetik experiment Beredning av reagenser för en fluorescens-baserad kinetiska DNA-bindande experiment på ett stoppat-flöde liknar den för en jämvikt experiment på ett fluorometer. Faktum jämvikt bindande analys bör utföras först uppskatta dissociationskonstanten (K D) för samverkan i syfte att optimera reaktionen förutsättningar för kinetisk a...

<ol>
	<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transient-state+kinetics.">Advances in transient-state kinetics.</a> Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).</li><li>Johnson, K. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Kinetic analysis of macromolecules. , (2003).</li><li>Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+mismatch+repair+protein+MutS+and+its+complex+with+a+substrate+DNA.">Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA.</a> Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).</li><li>Lamers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+DNA+mismatch+repair+protein+MutS+binding+to+a+G+x+T+mismatch.">The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch.</a> Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).</li><li>Warren, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+MutSalpha+DNA+lesion+recognition+complex.">Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex.</a> Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).</li><li>Kunkel, T. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).</li><li>Jiricny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+mismatch-repair+system.">The multifaceted mismatch-repair system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).</li><li>Hsieh, P., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+mismatch+repair:+Molecular+mechanism,+cancer,+and+ageing.">DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).</li><li>Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+nucleotides+on+MutS-DNA+binding+kinetics+clarify+the+role+of+MutS+ATPase+activity+in+mismatch+repair.">The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair.</a> J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).</li><li>Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Msh2+and+Msh6+subunits+to+the+asymmetric+ATPase+and+DNA+mismatch+binding+activities+of+Saccharomyces+cerevisiae+Msh2-Msh6+mismatch+repair+protein.">Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein.</a> DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).</li><li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+recognition-coupled+stabilization+of+Msh2-Msh6+in+an+ATP-bound+state+at+the+initiation+of+DNA+repair.">Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair.</a> Biochemistry. 42 (25), 7682-7693 (2003).</li><li>Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction+and+analysis+of+eukaryotic+multiprotein+complexes+in+Escherichia+coli+using+a+dual-vector+strategy.">Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy.</a> Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).</li><li>Zhai, J., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.+cerevisiae+Msh2-Msh6+DNA+binding+kinetics+reveal+a+mechanism+of+targeting+sites+for+DNA+mismatch+repair.">S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct,+real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase.">Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li><li>Brune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inorganic+phosphate+interaction+with+phosphate+binding+protein+from+Escherichia+coli.">Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli.</a> Biochemistry. 37 (29), 10370-10380 (1998).</li><li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+ATP+binding+and+hydrolysis+activity+of+the+Thermus+aquaticus+MutS+dimer+is+key+to+modulation+of+its+interactions+with+mismatched+DNA.">Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA.</a> Biochemistry. 43 (41), 13115-13128 (2004).</li><li>Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+mismatch+recognition+complex+hMSH2-hMSH6+functions+as+a+novel+molecular+switch.">The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch.</a> Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).</li><li>Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Msh6+ATPase+activity+by+mispaired+DNA+induces+a+Msh2(ATP)-Msh6(ATP)+state+capable+of+hydrolysis-independent+movement+along+DNA.">Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA.</a> Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).</li></ol>

Exemplet med en DNA mismatch protein som beskrivs här illustrerar kraften och nyttan av övergående kinetiska metoder för att studera de mekanismer av biologiska molekyler. Stoppad-flödesmätning om den gemensamma omsättningen tidsskalan som entydiga bevis för snabb och specifik bindning av MSH2-Msh6 protein till ett omaka baspar och bildandet av ett långlivat protein X DNA-komplex i reaktionen 9. Dessutom tillhandahålls slutade-flöde (och släcka-flöde) analys av ATPas aktivitet direkta bevis för ...

<table border="1"><tr><td> DNA namn </td><td> Sekvens </td></tr><tr><td> 37 G </td><td> 5&#39;-ATT TCC TTC AGC AGA TAT G TA CCA TAC TGA TTC ACA T -3 &quot; </td></tr><tr><td> 37 T (2-Ap) </td><td> 5&#39;-ATG TGA ATC AGT ATG GTA T Ap T ATC TGC TGA AGG AAA T -3 &quot; </td></tr><tr><td> 37 T </td><td> 5&#39;-ATG TGA ATC AGT ATG GTA T En T ATC TGC TGA AGG AAA T -3 &quot; </td></tr></table>

application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a dna repair protein

Övergående kinetisk analys är nödvändig för att förstå fungerar biologiska makromolekyler, eftersom denna metod ger mekanistiska information inklusive aktiva site koncentrationer och inneboende konstanter takt som styr makromolekylära funktion. I händelse av enzymer, till exempel, övergående eller pre-steady state mätningar identifiera och karaktärisera enskilda händelser i reaktionen väg, medan steady-state mätningar endast ger övergripande katalytisk effektivitet och specificitet. Enskilda händelser som protein-protein eller protein-ligand interaktioner och hastighetsbestämmande konformationsändringar förekommer ofta i millisekund tid, och kan mätas direkt med stoppade flöde och kemisk-släcka flöde metoder. Med tanke på en optisk signal som fluorescens, stannade-flöde fungerar som ett kraftfullt och lättillgängligt verktyg för att övervaka reaktion framsteg från substrat binda till produktlansering och katalytisk omsättningen 1,2. Här rapporterar vi tillämpa slutade flöde kinetik att söka av verkningsmekanismen för MSH2-Msh6, en eukaryot DNA-reparation protein som erkänner baspar obalanser och insättning / borttagning loopar i DNA och signaler mismatch reparation (MMR) 3-5. På så sätt hjälper MSH2-Msh6 ökar noggrannheten i DNA-replikation av tre tiopotenser (felfrekvens minskar från ~ 10 -6 till 10 -9 baser), och därmed bevara genomisk integritet. Inte överraskande är defekt mänsklig MSH2-Msh6 funktion i samband med ärftlig icke-polypos tjocktarmscancer och andra sporadiska cancerformer 6-8. För att förstå verkningsmekanismen av denna kritiska DNA metabola protein, vi sondera dynamiken i MSH2-Msh6 interaktion med inkompatibla DNA samt ATPas aktivitet som drivmedel sitt handlande i MMR. DNA-bindande mäts genom att snabbt blanda MSH2-Msh6 med DNA som innehåller en 2-aminopurine (2-Ap) fluoroforen anslutning till ett G: T obalans och övervaka den resulterande ökningen i 2-aminopurine fluorescens i realtid. DNA dissociation mäts genom att blanda förformade MSH2-Msh6 G: T (2-Ap) mismatch komplex med omärkta fälla DNA och övervakning minskning fluorescens över tiden 9. Pre-steady state ATPas kinetik mäts genom förändringen i fluorescens av 7-dietylamino-3-((((2-maleimidyl) etyl) amino) karbonyl) kumarin)-märkta fosfat bindande protein (MDCC-PBP) om bindande fosfat ( Pi) släpptes av MSH2-Msh6 efter ATP hydrolys 9,10. Uppgifterna visar en snabb bindning av MSH2-Msh6 till ett G: T obalans och bildandet av ett långlivat MSH2-Msh6 G: T komplex, vilket i sin tur resulterar i hämning av ATP hydrolys och stabilisering av protein i en ATP-bunden form . Den reaktionskinetik ger tydligt stöd för hypotesen att ATP-bundet MSH2-Msh6 signaler DNA-reparation om bindande ett omaka baspar i dubbelspiral. F. Noah Biro och Jie Zhai bidragit till detta papper lika.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein at JoVE.com

Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

MSH2-Msh6 är ansvarig för att initiera reparation av replikering fel i DNA. Här presenterar vi ett övergående kinetik strategi för att förstå hur denna kritiska proteinet fungerar. Rapporten belyser slutade flöde experiment för att mäta det kopplade DNA-bindande och ATPas kinetik underliggande MSH2-Msh6 verkningsmekanism i DNA-reparation.

Tillämpning av Stoppad-flöde Kinetics metoder för att undersöka verkningsmekanismen av en DNA Repair Protein

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

DNA Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Genetiska studier av människans proteiner DNA Repair använder jäst som modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Reparation och cellulära svaren på DNA-skador i Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Använda optokinetic svar att studera visuell funktion zebrafisk

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Betydelsen av korrekt proteinkoncentration för kinetik och affinitet Bestämning i struktur och funktion Analys

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Applicering av en<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Protection Assay att visualisera Egenskaper Stress medling Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

Utveckling av inhibitorer av protein-proteininteraktioner genom BYT: Ansökan till Design och utveckling Non-ATP Konkurrens CDK-hämmare

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Kromatin Immunoprecipitation analys för identifiering av Arabidopsis Protein-DNA-interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Förstärkning, Nästa generations sekvensering, och Genomic DNA Kartläggning av retroviral integration webbplatser

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Avancerad konfokalmikroskopi tekniker för att studera Protein-protein interaktioner och kinetik på DNA lesioner

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...