Name: application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a dna repair protein
Uploaded: 2010-03-31T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein at JoVE.com

Bu çalışma, bir NSF KARİYER Ödülü (MMH), Barry M. Goldwater bursu (FNB) ve ASBMB Lisans Araştırma Ödülü (CWD) tarafından desteklenmiştir. PBP, ifade için klon lütfen Dr. Martin Webb (MRC, UK) tarafından sağlanmıştır.

Msh2 Msh6 DNA Cilt Kinetiği A. Ölçüm 1. Msh2-Msh6 DNA bağlayıcı kinetik deney için numune hazırlama Durdurulmuş bir akış bir floresans tabanlı kinetik DNA bağlayıcı deney için reaktiflerin hazırlanması, bir flüorometre bir denge deney için benzer. Aslında denge bağlayıcı analizi, kinetik analizi için reaksiyon koşulları optimize etmek için etkileşim için ayrışma sabiti (K D) tahmin etmek için ilk olarak yapılmalı...

<ol>
	<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transient-state+kinetics.">Advances in transient-state kinetics.</a> Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).</li><li>Johnson, K. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Kinetic analysis of macromolecules. , (2003).</li><li>Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+mismatch+repair+protein+MutS+and+its+complex+with+a+substrate+DNA.">Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA.</a> Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).</li><li>Lamers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+DNA+mismatch+repair+protein+MutS+binding+to+a+G+x+T+mismatch.">The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch.</a> Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).</li><li>Warren, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+MutSalpha+DNA+lesion+recognition+complex.">Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex.</a> Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).</li><li>Kunkel, T. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).</li><li>Jiricny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+mismatch-repair+system.">The multifaceted mismatch-repair system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).</li><li>Hsieh, P., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+mismatch+repair:+Molecular+mechanism,+cancer,+and+ageing.">DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).</li><li>Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+nucleotides+on+MutS-DNA+binding+kinetics+clarify+the+role+of+MutS+ATPase+activity+in+mismatch+repair.">The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair.</a> J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).</li><li>Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Msh2+and+Msh6+subunits+to+the+asymmetric+ATPase+and+DNA+mismatch+binding+activities+of+Saccharomyces+cerevisiae+Msh2-Msh6+mismatch+repair+protein.">Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein.</a> DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).</li><li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+recognition-coupled+stabilization+of+Msh2-Msh6+in+an+ATP-bound+state+at+the+initiation+of+DNA+repair.">Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair.</a> Biochemistry. 42 (25), 7682-7693 (2003).</li><li>Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction+and+analysis+of+eukaryotic+multiprotein+complexes+in+Escherichia+coli+using+a+dual-vector+strategy.">Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy.</a> Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).</li><li>Zhai, J., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.+cerevisiae+Msh2-Msh6+DNA+binding+kinetics+reveal+a+mechanism+of+targeting+sites+for+DNA+mismatch+repair.">S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct,+real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase.">Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li><li>Brune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inorganic+phosphate+interaction+with+phosphate+binding+protein+from+Escherichia+coli.">Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli.</a> Biochemistry. 37 (29), 10370-10380 (1998).</li><li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+ATP+binding+and+hydrolysis+activity+of+the+Thermus+aquaticus+MutS+dimer+is+key+to+modulation+of+its+interactions+with+mismatched+DNA.">Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA.</a> Biochemistry. 43 (41), 13115-13128 (2004).</li><li>Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+mismatch+recognition+complex+hMSH2-hMSH6+functions+as+a+novel+molecular+switch.">The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch.</a> Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).</li><li>Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Msh6+ATPase+activity+by+mispaired+DNA+induces+a+Msh2(ATP)-Msh6(ATP)+state+capable+of+hydrolysis-independent+movement+along+DNA.">Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA.</a> Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).</li></ol>

Burada açıklanan DNA uyumsuzluğu bağlayıcı protein örneği, biyolojik moleküllerin mekanizmaları çalışmak için geçici kinetik yöntemler ve yardımcı güç göstermektedir. Tek ciro zaman ölçekte Durduruldu akış ölçümleri, uyumsuz bir baz çifti ve reaksiyon 9 uzun ömürlü bir protein X DNA kompleksi oluşumu Msh2-Msh6 protein hızlı ve belirli bağlayıcı için net bir kanıt sağladı. Ayrıca, ATPaz aktivitesi durdu akışı (ve quench akış) analizi, eşleşmeyen DNA bağla...

application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a dna repair protein

Bu yaklaşımın mekanistik bilgi makromoleküler fonksiyonu yöneten etkin sitenin konsantrasyonları ve içsel hız sabitleri dahil verimleri beri Geçici kinetik analizi, biyolojik makromoleküllerin işleyişini anlamak için vazgeçilmez bir unsurdur. Kararlı durum ölçümleri, sadece genel katalitik verimliliği ve özgünlüğü verimi ise, enzimler durumda, örneğin, geçici ya da önceden istikrarlı bir devlet ölçümleri tanımlamak ve reaksiyon yolu bireysel olayları karakterize. Bireysel, protein-protein ya da protein-ligand etkileşimleri ve hız sınırlayıcı yapı değişiklikleri gibi olaylar sık ​​sık milisaniyelik zaman ölçeğinde meydana gelen ve durdu akışı ve kimyasal quench akış yöntemleri ile doğrudan ölçülebilir. Gibi floresan gibi bir optik sinyal durdu akış ürün sürümü ve katalitik cirosu 1,2 bağlayıcı substrat izleme tepki ilerleme için güçlü ve ulaşılabilir bir araç olarak hizmet vermektedir . Burada, durdu akış kinetiği uygulama Msh2-Msh6 etki mekanizması, baz çifti uyumsuzlukları ve DNA ve sinyalleri uyumsuzluğu onarım (MMR) 3-5 ekleme / silme döngüleri tanıyan bir ökaryotik DNA onarım protein prob rapor. Bunu yaparken, böylece Msh2 Msh6 büyüklükte üç siparişleri (~ 10 -6 to10 -9 üsleri hata sıklığı azalır) DNA replikasyonu doğruluğunu artırır ve genomik bütünlüğünü korumaya yardımcı olur . Beklendiği gibi, insan kusurlu Msh2-Msh6 fonksiyonu kalıtsal non-polipozis kolon kanseri ve diğer sporadik kanserler 6-8 ile ilişkilidir. Bu kritik DNA metabolik protein eylem mekanizmasını anlamak için, eşleşmeyen DNA gibi ATPaz aktivitesi Msh2 Msh6 etkileşim dinamikleri problama yakıtlar MMR olarak eylemler. T uyumsuzluğu ve izleme, gerçek zamanlı olarak 2-aminopurine floresan ortaya çıkan artış: DNA bağlayıcı G bitişik 2-aminopurine (2-Ap) fluorofor içeren DNA ile hızla Msh2-Msh6 karıştırma ile ölçülür. T (2-Ap) etiketsiz tuzak DNA ve izleme süresi 9 üzerinde floresan azalma ile uyumsuzluğu kompleksi: DNA disosiasyon önceden oluşmuş Msh2-Msh6 G karıştırılarak ölçülür. Pre-kararlı durum ATPaz kinetiği 7-diethylamino-3-((((2-maleimidyl) etil) amino) karbonil) kumarin) etiketli bağlayıcı fosfat Fosfat Bağlayıcı Protein (MDCC-PBP) (floresan değişimi ile ölçülür Pi) ATP hidrolizi 9,10 Msh2-Msh6 tarafından yayınlandı. T uyumsuzluğu ve oluşumu uzun ömürlü bir Msh2-Msh6 G: Bu veriler G Msh2-Msh6 hızlı bağlanma ortaya T kompleksi bağlı bir ATP şeklinde proteinin ATP hidroliz ve istikrar baskılanması teslim sonuçları . Reaksiyon kinetiği hipotez için açık destek sağlayan ATP bağlı Msh2 Msh6 sinyaller uyumsuz bir baz çifti bağlayıcı çift sarmal DNA onarım. F. Nuh Biro ve Jie Zhai Bu çalışmada eşit katkıda bulunmuştur.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein at JoVE.com

Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

Msh2 Msh6 DNA replikasyon hataları tamir başlatmak için sorumludur. İşte bu kritik protein nasıl çalıştığını anlamak yolunda geçici bir kinetiği yaklaşım sunuyoruz. Rapor durdu akış birleştiğinde DNA bağlayıcı ve eylem Msh2-Msh6 DNA onarım mekanizması altında yatan ATPaz kinetiği ölçmek için deneyler göstermektedir.

DNA Onarım Protein Eylem Mekanizması Soruşturma Durduruldu akış Kinetiği Yöntemleri Uygulama

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

DNA Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Zebrafish görme fonksiyonu çalışma optokinetik yanıt

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Bir uygulama<em&gt; In vitro</emDPS Protein Stres Arabuluculuk Özellikleri gözünüzde canlandırın için&gt; DNA Koruma Testi

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

Aracılığıyla DEĞİŞTİR Protein-protein etkileşimleri İnhibitörlerinin Geliştirilmesi: Tasarım ve Geliştirme Olmayan ATP Rekabetçi CDK inhibitörleri Uygulama

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...