Name: fluorescent labeling of cos-7 expressing snap-tag fusion proteins for live cell imaging
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging at JoVE.com

كاي جونسون ايفان كوريا أندرياس بريشت كاترين Müentener كريس نورين أحد لوه مينج شو تيودور ديفيز سالفاتوري Russello أيهوا تشانغ الإنكا غوش اليسا Maunus نيكولاس ابارث جيمس ماكفارلاند جون Buswell بريندا ديزموند جيمس Ellard دون مشط

الطلاء CHO - K1 خلايا : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 100μl من خلايا K1 CHO التي تم trypsinized وفقا لبروتوكولات موحدة ل6ml من اكتمال F - 12K. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج تعليق خلية pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات ، ثم قسامة 300 ميكرولتر من التعليق على كل خلية trypsinized جيدا معقمة 8 غرفة مختبر تيك ساترة يحتل هيئة تشريعية الثانية مع 1.5 # البورسليكات ساترة غرف (Nalgene نونك الباحث ؛ المنتج # 155409 ؛ الكثير : 100808-8-0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 بين عشية وضحاها. </li></ol> عابر ترنسفكأيشن من CHO - K1 مع خلايا pSNAP - ADRB2 وpSNAP H2B - : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من خلية ثقافة غرف المصنفة في اليوم السابق للبحث عن كثافة الخلايا والصحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية العدد المناسب من الأنابيب microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في التدفق الصفحي هود ، إعداد الخلائط ترنسفكأيشن المعقدة وفقا للرسم البياني عينة التالية ، وذلك باستخدام إما 0.3 ميكروغرام pSNAP ADBR2 - DNA البلازميد أو التحكم 0.3 ميكروغرام من الحمض النووي للمراقبة pSNAP - H2B البلازميد ، 1 ميكرولتر من TransPass D2 و 1 ميكرولتر الخامس TransPass في رد الفعل. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> البلازميد </td><td> عدد من ردود الفعل </td><td> ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة </td><td> ميكرولتر من D2 TransPass </td><td> ميكرولتر الخامس TransPass </td><td> ميكرولتر من DNA البلازميد </td><td> ميكرولتر من D2/reaction TransPass </td><td> ميكرولتر الخامس TransPass / رد فعل </td><td> نانوغرام من الحمض النووي / رد فعل </td><td> اضرب الحمض النووي. (نانوغرام / ميكرولتر) </td><td> ميكرولتر من DNA البلازميد / رد فعل </td></tr><tr><td> SNAP - ADRb2 </td><td> 5 </td><td> 236.5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472.34 </td><td> 0.7 </td></tr><tr><td> H2B - SNAP </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515.89 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> همية </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Untransfected </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، مزيج الحرة المصل F - 12K مع الحمض النووي للبلازميد المناسبة ، ثم إضافة الكاشف TransPass ترنسفكأيشن D2 ، ثم إضافة ترنسفكأيشن الخامس TransPass الكاشف. مزج المكونات جيدا pipetting بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات بعد إضافة كل كاشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان تفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء الحضانة ، وغسل خلايا مرة واحدة مع 600 ميكرولتر من DMEM كاملة وإضافة 450 ميكرولتر من DMEM الكامل إلى كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكروليتر من خليط معقد ترنسفكأيشن لكل عينة ، ببطء وبطريقة حكيمة المنسدلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان نماذج ليلا 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2. </li></ol> SNAP الخلوي TMR صفها نجمة خلايا - K1 CHO Transfected عابر مع pSNAP - ADRB2 وpSNAP H2B - : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية وسائل الإعلام ترنسفكأيشن تعقيدا من كل عينة عن طريق الشفط فراغ. غسل الخلايا مرتين مع 600 ميكرولتر من اكتمال F - 12K واستبدال وسائل الإعلام في كل بئر مع 600 ميكرولتر من اكتمال F - 12K. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج سائل الإعلام وسم الصبغة بإضافة 995 ميكروليتر من اكتمال 12K - F و 51 ميكرولتر 0.6 مم SNAP سيل الركيزة TMR ستار. وينبغي تركيز النهائي من SNAP سيل ستار TMR يكون 3mM. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط بعد إضافة الركيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية وسائط النمو من عينات وإضافة 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام الوسم صبغ كل جانب. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما تحتضن العينات ، وإعداد هويشت 33342 حل لتلطيخ النووي لعينات عن طريق خلط 1 ميكرولتر من هويشت 33342 ، trihydrochloride ، هيدرات (10 ملغ / مل حل في الماء و 16.2 ملي حل ؛ مجسات Invitrogen الجزيئية) في 10 مل من اكتمال 12K - F . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام من جميع العينات وإضافة 600 ميكرولتر من محلول مخفف لهويشت كل عينة. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات ثلاث مرات مع 600 ميكرولتر من اكتمال F - 12K. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة إضافية للسماح لنشر fluorophore الفردية خارج الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة ، وتغير وسائل الإعلام على عينات SNAP سيل للمرة الأخيرة ، والشروع في التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة الخلايا باستخدام مجهر زايس Apotome 200M Axiovert الفلورسنت. </li></ol> ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. هنابعض النتائج ممثل الفلورسنت التصوير باستخدام المجهر الفلورسنت القياسية من الخلايا COS - 7 العيش التي هي تعبير عن SNAP - علامة اندماج. هذه الصورة الأولى يظهر يعيش COS - 7 - pSNAP معربا عن الخلايا H2B (النووية هيستون) المسمى مع الخلوي SNAP TMR ستار. ولدت في بناء pSNAP - H2B باستخدام العلامة pSNAP - (م) النواقل. وصفت الخلايا مع SNAP سيل ستار TMR لمدة 30 دقيقة مع وcounterstained هويشت 33342 (أزرق) للنوى. ومضان الوردي يوضح التراكب من مضان أحمر حيث بروتين موجود في هيستون بالإضافة إلى مضان زرقاء تشير إلى النواة. ومن الواضح أن وسهولة التعرف على التعبير عن بروتين H2B. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكلين 2 و 3 ، وهذه الصور تظهر المقبلتين يعيش COS - 7 خلايا transfected عابر مع pSNAP - ADRβ2. وصفت الخلايا مع الخلوي SNAP TMR ستار (الحمراء) ، وcounterstained مع هويشت 33342 (الأزرق). ولدت في بناء pSNAP - ADRβ2 باستخدام العلامة pSNAP - (م) النواقل. وصفت الخلايا مع SNAP سيل ستار TMR لمدة 30 دقيقة مع وcounterstained هويشت 33342 (أزرق) للنوى. ومضان أحمر يدل على وجود بروتين سطح الخلية ADRB2 مستقبلات اللون الأزرق بينما يحدد مضان النواة.

<ol>
	<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells.">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP-tag+Technologies:+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function.">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li></ol>

ويعمل المؤلفون من خلال نيو إنجلاند Biolabs التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

هناك العديد من المتغيرات التي تؤثر على النتائج لوحظ كثافة مثل تركيز الليزر ، وقدرات المعدات والعدسة المستخدمة ، إلخ صمود للضوء لfluorophore يحدد مدى السرعة التي يجب أن يتم القبض مضان قبل أن يتلاشى. هذه الطريقة لوضع العلامات البروتين هي متعددة ومناسبة للعديد من التطبيقات. SNAP - CLIP العلامة والعلامة التكنولوجيات لوضع العلامات المحددة للبروتينات اندماج مع تحقيقات الاصطناعية تمكين مختلف جوانب وظيفة البروتين ، بما في ذلك مجموعة متنوعة من العمليات الحيوية في الخلايا الحية وlysates في الخلية. SNAP ، CLIP ، وMCP ACP - العلامة تكنولوجيات توفير البساطة وبراعة غير عادية في التصوير من البروتينات في الخلايا الحية والثابتة ولدراسة البروتينات في المختبر. إنشاء بناء جين واحد ينتج بروتين قادر على الانصهار الموسومة تشكيل الروابط التساهمية لمجموعة متنوعة من الفئات الوظيفية ، بما في ذلك fluorophores ، البيوتين ، أو الخرز. يجب أن تكون مستنسخة من البروتين وأعربت عن الفائدة مرة واحدة فقط ومن ثم يمكن استخدامها في الانصهار مع مجموعة متنوعة من ركائز الفلورسنت لتطبيقات عديدة مثل المصب الوسم في وقت واحد من البروتين داخل الخلايا الحية ، والترجمة البروتين إزفاء ، نبض مطاردة التجارب والدراسات استيعاب مستقبلات وانتقائية العلامات سطح الخلية والبروتين هدم المقايسات ، كشف عن البروتين في SDS - PAGE ، التدفق الخلوي ، وارتفاع إنتاجية المقايسات ملزمة في لوحات microtiter ، والتجارب تفاعل جهاز الاستشعار البيولوجي ، والحنق على أساس المقايسات ملزمة.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CHO-K1 Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CCL-61</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Serum free F-12K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene Nunc Int.</td>
<td>155409</td>
<td>Lot: 100808-8-0</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Molecular Probes</td>
<td>H3570</td>
<td>470519</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transpass V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M2561S</td>
<td>0030709</td>
</tr>
<tr>
<td>Transpass D2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M2554S</td>
<td>0060802</td>
</tr>
<tr>
<td>SNAP-Cell TMR Star</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>S9105S</td>
<td>0010811</td>
</tr>
<tr>
<td>pSNAP-ADBR2 Control Plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N9178S</td>
<td>0010811</td>
</tr>
<tr>
<td>pSNAP-H2B Control Plasmid </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N9179S</td>
<td>0010811</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescent labeling of cos-7 expressing snap-tag fusion proteins for live cell imaging

SNAP - CLIP العلامة والعلامة ، نظم التوسيم البروتين تمكين محددة ، المرفق من الجزيئات التساهمية ، بما في ذلك الأصباغ الفلورية ، وبروتين من الاهتمام في الخلايا الحية. هذه النظم نقدم مجموعة واسعة من ركائز الفلورسنت الأمثل لمجموعة من الأجهزة التصوير. وأعرب عن مرة واحدة مستنسخة ، ويمكن استخدام هذا البروتين المفتاحية مع مجموعة متنوعة من ركائز لتطبيقات عديدة المصب دون الحاجة إلى استنساخ مرة أخرى. هناك نوعان من الخطوات لاستخدام هذا النظام : الاستنساخ والتعبير عن بروتين من الفائدة انصهار SNAP - العلامة ، والوسم من الانصهار مع الركيزة SNAP - علامة الاختيار. الأداة الإضافية العلامة هو بروتين صغير استنادا O الإنسان<sup&gt; 6</sup&gt; - alkylguanine - DNA - alkyltransferase (hAGT) ، وهو بروتين إصلاح الحمض النووي. SNAP - العلامة التسميات الأصباغ مترافق لجوانين أو ترك مجموعات chloropyrimidine عبر رابط البنزيل. في رد فعل العلامات ، يتم إرفاق تساهمي المجموعة استبداله بنزيل من الركيزة إلى العلامة - SNAP. CLIP - البطاقة هي نسخة معدلة من العلامة - SNAP وهندستها لتتفاعل مع benzylcytosine بدلا من المشتقات benzylguanine. عندما تستخدم بالاقتران مع البطاقات ، SNAP ، CLIP - العلامة يمكن وسم متعامد والتكميلية في وقت واحد من اثنين من البروتينات في الخلايا نفسها.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging at JoVE.com

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP - CLIP العلامة والعلامة ، نظم التوسيم البروتين تمكين محددة ، المرفق من الجزيئات التساهمية ، بما في ذلك الأصباغ الفلورية ، وبروتين من الاهتمام في الخلايا الحية. وأعرب عن مرة واحدة مستنسخة ، ويمكن استخدام هذا البروتين المفتاحية مع مجموعة متنوعة من ركائز لتطبيقات عديدة المصب دون الحاجة إلى استنساخ مرة أخرى.

الفلورسنت وصفها من COS - 7 تعرب عن البروتينات الانصهار SNAP - شعارا لتصوير الخلايا الحية

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

بطاقات المواد الفلورية ذبابة الفاكهة</emهياكل القلب>

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconversion منقى من البروتينات ونيون المزدوجة التحقيق تسليط الضوء البصري في الخلايا الحية

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

تعبير البروتينات الفلورية الانصهار في مورين الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...