Name: fluorescent labeling of cos-7 expressing snap-tag fusion proteins for live cell imaging
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging at JoVE.com

Kai Johnsson Ivan Correa Andreas Brecht Katrin Müentener Chris Noren Luo zon Ming Xu Theodore Davis Salvatore Russello Aihua Zhang Inca Ghosh Elissa Maunus Nicholas Labarthe James MacFarland John Buswell Brenda Desmond James Ellard Don Kam

Plating CHO-K1 cellen: <ol><li> Voeg 50-100μl van de CHO-K1 cellen die zijn getrypsiniseerd volgens standaard protocollen om 6 ml van complete F-12K. </li><li> Meng celsuspensie door en neer te pipetteren meerdere malen, dan aliquot 300 ul van getrypsiniseerd celsuspensie aan elke well van een steriele kamer 8-Lab-Tek II Chambered dekglaasje met # 1.5 borosilicaat dekglaasje kamers (Nalgene Nunc Int;. Product # 155409; Lot: 100808-8-0). </li><li> Incubeer monsters bij 37 ° C, 5% CO 2 &#39;s nachts. </li></ol> Voorbijgaande Transfectie van CHO-K1 cellen met pSNAP-ADRB2 en pSNAP-H2B: <ol><li> Controleer of de celkweek kamers gezaaid op de vorige dag om te zoeken naar celdichtheid en gezondheid. </li><li> Etiket het juiste aantal microcentrifuge buizen. </li><li> In een laminaire stroming kap, opgericht transfectie complexe mengsels op basis van het volgende voorbeeld grafiek, met behulp van 0,3 microgram pSNAP-ADBR2 controle plasmide DNA of 0,3 ug van pSNAP-H2B controle plasmide DNA, 1 ui Transpass D2 en 1 pi Transpass V per reactie. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> plasmide </td><td> aantal reacties </td><td> il serum-vrij medium </td><td> pi Transpass D2 </td><td> pi Transpass V </td><td> ul plasmide DNA </td><td> pi Transpass D2/reaction </td><td> ul van Transpass V / reactie </td><td> ng van DNA / reactie </td><td> DNA-conc. (Ng / ul) </td><td> il van plasmide DNA / reactie </td></tr><tr><td> SNAP-ADRb2 </td><td> 5 </td><td> 236,5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472,34 </td><td> 0.7 </td></tr><tr><td> H2B-SNAP </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515,89 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Bespotten </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Ongetransfecteerde </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li> De eerste, mix het serum vrij F-12K met de juiste plasmide DNA, dan is vervolgens de Transpass D2 transfectiereagens toe te voegen, voeg de Transpass V transfectiereagens. Meng de componenten door en neer te pipetteren voorzichtig in enkele keren na de toevoeging van elk reagens. </li><li> Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Tijdens de incubatie, een keer wassen cellen met 600 pi DMEM compleet en voeg 450 ul van de volledige DMEM aan elk monster. </li><li> Voeg 50 ul van de transfectie complex mengsel aan elk monster, langzaam en in een drop-wijs mode. </li><li> Incubeer de monsters overnacht bij 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> SNAP-Cell TMR Star Labeling van CHO-K1 cellen transient getransfecteerd met pSNAP-ADRB2 en pSNAP-H2B: <ol><li> Verwijder voorzichtig de transfectie complexe media van elk monster door afzuiging. Twee keer wassen cellen met 600 pi van volledige F-12K en vervang media in elk putje met 600 ul van complete F-12K. </li><li> Mix kleurstof etikettering media door het toevoegen van 995 ul van complete F-12K en 51 ul 0,6 mM SNAP-Cell TMR-Star substraat. De uiteindelijke concentratie van SNAP-Cell TMR-Star moet worden 3mm. Pipet op en neer een paar keer te mengen na de toevoeging van substraat. </li><li> Verwijder voorzichtig de groei van de media-monsters en voeg 200 ul van kleurstof etikettering media aan elke well. Incubeer monsters bij 37 ° C, 5% CO 2 gedurende 30 minuten. </li><li> Terwijl de monsters te incuberen, te bereiden Hoechst 33342 oplossing voor het nucleaire kleuring van de monsters door het mengen van 1 pi van Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydraat (10 mg / ml, oplossing in water, 16,2 mM oplossing; Invitrogen Molecular Probes) in 10 ml van de volledige F-12K . </li><li> Verwijder de media van alle monsters en voeg 600 ul van de verdunde Hoechst oplossing voor elk monster. Incubeer monsters bij 37 ° C, 5% CO 2 gedurende 5 minuten. </li><li> Was monsters drie keer met 600 ul van complete F-12K. </li><li> Incubeer de monsters bij 37 ° C, 5% CO 2 voor een extra 30 minuten om zonder rechtspersoonlijkheid fluorofoor uit diffuse van de cellen. </li><li> Na 30 minuten de media op het SNAP-Cell monsters nog een laatste keer en ga door naar beeldvorming. </li><li> Het imago van de cellen met behulp van een Zeiss apotome Axiovert 200M fluorescentie microscoop. </li></ol> Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Hier zijnenkele representatieve resultaten van het fluorescerende beeldvorming met behulp van standaard fluorescentie microscopie van levende COS-7 cellen die uiten SNAP-tag fusies. Deze eerste afbeelding toont live-COS-7 cellen die pSNAP-H2B (nucleaire histone) gemerkt met SNAP-Cell TMR-Star. De pSNAP-H2B construct werd gegenereerd met behulp van de pSNAP-tag (m) vector. De cellen werden gemerkt met SNAP-Cell TMR-Star gedurende 30 minuten en tegengekleurd met Hoechst 33342 (blauw) voor de kernen. De roze fluorescentie toont de overlay van de rode fluorescentie waar histon-eiwit aanwezig is in aanvulling op de blauwe fluorescentie onder vermelding van de kern. De expressie van het eiwit H2B is duidelijk en gemakkelijk te herkennen. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuren 2 en 3. Deze volgende twee afbeeldingen laten wonen COS-7 cellen transient getransfecteerd met pSNAP-ADRβ2. Cellen werden gemerkt met SNAP-Cell TMR-Star (rood) en tegengekleurd met Hoechst 33342 (blauw). De pSNAP-ADRβ2 construct werd gegenereerd met behulp van de pSNAP-tag (m) vector. De cellen werden gemerkt met SNAP-Cell TMR-Star gedurende 30 minuten en tegengekleurd met Hoechst 33342 (blauw) voor de kernen. De rode fluorescentie duidt op de aanwezigheid van het celoppervlak receptor-eiwit ADRB2 terwijl blauw fluorescentie identificeert de kern.

<ol>
	<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells.">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP-tag+Technologies:+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function.">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li></ol>

De auteurs zijn in dienst van New England Biolabs dat de reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

Er zijn een aantal variabelen die de waargenomen resultaten, zoals scherpstelling, laser intensiteit, de uitrusting mogelijkheden, lens gebruikt, enz. De fotostabiliteit van de fluorofoor bepaalt hoe snel de fluorescentie moet worden vastgelegd voordat vervagen. Deze methode van eiwit labeling is veelzijdig en geschikt voor vele toepassingen. SNAP-tag en CLIP-tag technologieën voor de specifieke etikettering van fusie-eiwitten met synthetische probes in staat stellen de verschillende aspecten van eiwitten functie, zoals een verscheidenheid aan dynamische processen in levende cellen en in cellysaten. SNAP-, clip-, MCP-en de ACS-tag technologieën bieden eenvoud en buitengewone veelzijdigheid aan de beeldvorming van eiwitten in levende cellen en vaste en de studie van eiwitten in vitro. De oprichting van een enkel gen te bouwen levert een gecodeerde fusie-eiwit in staat is de vorming van een covalente binding aan een verscheidenheid van functionele groepen, waaronder fluoroforen, biotine, of kralen. Het eiwit van de rente moet worden gekloond en uitgedrukt slechts een keer en dan is de fusie kan worden gebruikt met een verscheidenheid van fluorescerende substraten voor tal van stroomafwaartse toepassingen zoals gelijktijdige eiwit-etiket aan de binnenzijde levende cellen, eiwit lokalisatie en translocatie, pulse-chase experimenten, receptor internalisatie studies , selectieve celoppervlak etikettering, eiwit pull-down assays, eiwit detectie in SDS-PAGE, flowcytometrie, high-throughput bindingsassays in microtiterplaten, biosensor interactie experimenten en FRET-gebaseerde binding assays.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CHO-K1 Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CCL-61</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Serum free F-12K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene Nunc Int.</td>
<td>155409</td>
<td>Lot: 100808-8-0</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Molecular Probes</td>
<td>H3570</td>
<td>470519</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transpass V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M2561S</td>
<td>0030709</td>
</tr>
<tr>
<td>Transpass D2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M2554S</td>
<td>0060802</td>
</tr>
<tr>
<td>SNAP-Cell TMR Star</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>S9105S</td>
<td>0010811</td>
</tr>
<tr>
<td>pSNAP-ADBR2 Control Plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N9178S</td>
<td>0010811</td>
</tr>
<tr>
<td>pSNAP-H2B Control Plasmid </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N9179S</td>
<td>0010811</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescent labeling of cos-7 expressing snap-tag fusion proteins for live cell imaging

SNAP-tag en CLIP-tag eiwit labeling systemen maken het mogelijk de specifieke, covalente aanhechting van moleculen, inclusief fluorescente kleurstoffen, om een ​​eiwit van interesse in levende cellen. Deze systemen bieden een brede selectie van fluorescerende substraten geoptimaliseerd voor een reeks van imaging instrumentatie. Eenmaal gekloond en uitgedrukt, kunnen de gelabelde eiwit gebruikt worden met een verscheidenheid van substraten voor tal van downstream-applicaties zonder opnieuw te klonen. Er zijn twee stappen voor het gebruik van dit systeem: klonering en expressie van het eiwit van belang als een SNAP-tag fusion, en de etikettering van de fusie met de SNAP-tag substraat van keuze. De SNAP-tag is een klein eiwit gebaseerd op menselijke O<sup&gt; 6</sup&gt;-Alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), een DNA-herstel eiwit. SNAP-tag labels zijn kleurstoffen geconjugeerd aan guanine of chloropyrimidine vertrekkende groepen via een benzyl linker. In de etikettering reactie, is de gesubstitueerd benzyl groep van het substraat covalent gebonden aan de SNAP-tag. CLIP-tag is een aangepaste versie van SNAP-tag, ontworpen om te reageren met benzylcytosine in plaats van benzylguanine derivaten. Bij gebruik in combinatie met SNAP-tag, CLIP-tag maakt het mogelijk orthogonale en aanvullende etikettering van twee eiwitten tegelijk in dezelfde cellen.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging at JoVE.com

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag en CLIP-tag eiwit labeling systemen maken het mogelijk de specifieke, covalente aanhechting van moleculen, inclusief fluorescente kleurstoffen, om een ​​eiwit van interesse in levende cellen. Eenmaal gekloond en uitgedrukt, kunnen de gelabelde eiwit gebruikt worden met een verscheidenheid van substraten voor tal van downstream-applicaties zonder opnieuw te klonen.

Fluorescerende Labeling van COS-7 tot expressie SNAP-tag fusieproteïnen voor live cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Labeling stamcellen met fluorescente kleurstoffen voor niet-invasieve detectie met optische beeldvorming

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

TL-etikettering van Drosophila Hart Structuren

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplantatie van GFP-expressie blastomeren voor Live Beeldvorming van het netvlies en de ontwikkeling van de hersenen in chimère zebravis embryo&#39;s

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconversion van gezuiverde fluorescerende eiwitten en dual-probe optische markering in levende cellen

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Twee-en drie-dimensionale live cell imaging van DNA schade respons Eiwitten

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Imaging leven van GFP-gemerkte eiwitten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Expressie van fluorescerende Fusion eiwitten in lymfkliertest beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...