Name: fluorescent labeling of cos-7 expressing snap-tag fusion proteins for live cell imaging
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging at JoVE.com

קאי Johnsson איוון קוראה אנדריאס ברכט קתרין Müentener כריס נורן לואו יום ראשון שו מינג תיאודור דייויס סלווטורה Russello Aihua ג&#39;אנג האינקה גוש אליסה Maunus ניקולס Labarthe ג&#39;יימס מקפרלנד ג&#39;ון באזוול ברנדה דזמונד ג&#39;יימס Ellard דון מסרק

ציפוי CHO-K1 תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50-100μl של CHO-K1 תאים שעברו trypsinized על פי פרוטוקולים סטנדרטיים כדי להשלים 6ml של ה-F-12k. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה על ידי תא pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים, ולאחר מכן 300 aliquot μl של השעיה תא trypsinized היטב כל סטרילית 8-קאמרית Lab-Tek II החדרים Coverglass עם # 1.5 בורוסיליקט coverglass לתאי (Nalgene Int Nunc;. Product # 155409; מגרש: 100808-8-0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לילה. </li></ol> Transfection חלוף של CHO-K1 תאים עם pSNAP-ADRB2 pSNAP ו-H2B: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התרבות התאים בתאי זרע ביום הקודם לחפש צפיפות התאים ובריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית המספר המתאים של צינורות microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף זרימה למינרית, להגדיר תערובות transfection מורכבים על פי תרשים הדוגמה הבא, או באמצעות 0.3 מיקרוגרם pSNAP ADBR2-DNA בקרה פלסמיד או 0.3 מיקרוגרם של ה-DNA pSNAP-H2B בקרה פלסמיד, 1 μl של D2 TransPass ו 1 μl של TransPass V לכל תגובה. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> הפלסמיד </td><td> מספר תגובות </td><td> μl של המדיום סרום ללא </td><td> μl של D2 TransPass </td><td> μl של TransPass V </td><td> μl של ה-DNA פלסמיד </td><td> μl של D2/reaction TransPass </td><td> μl של TransPass V / תגובה </td><td> ng של DNA / תגובה </td><td> ה-DNA קונצרט כלשהו. (Ng / μl) </td><td> μl של ה-DNA פלסמיד תגובה / </td></tr><tr><td> Snap-ADRb2 </td><td> 5 </td><td> 236.5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472.34 </td><td> 0.7 </td></tr><tr><td> H2B-SNAP </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515.89 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> ללעוג </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Untransfected </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לערבב החופשי בסרום F-12k עם ה-DNA פלסמיד מתאים, ואז מוסיפים את מגיב D2 TransPass transfection, ואז מוסיפים את מגיב V TransPass transfection. מערבבים את המרכיבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה מספר פעמים לאחר תוספת של כל מגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, רוחצים תאים פעם אחת עם 600 μl של DMEM להשלים ולהוסיף 450 μl של DMEM מלאה מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של התערובת transfection מורכב מדגם זה, לאט בצורה טיפה חכם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> Snap-Cell TMR כוכב תיוג של CHO-K1 תאים transfected transiently עם pSNAP-ADRB2 pSNAP ו-H2B: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את התקשורת transfection מורכב מכל מדגם ידי יניקה ואקום. שטפו פעמיים עם תאים μl 600 של שלמה F-12k ולהחליף התקשורת היטב כל אחד עם 600 μl של שלמה F-12k. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקס מדיה לצבוע תיוג על ידי הוספת 995 μl של שלמה F-12k ו 51 μl 0.6 SNAP-Cell mM TMR-Star המצע. הריכוז הסופי של snap-Cell Star-TMR צריך להיות 3mm. פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לערבב לאחר תוספת של המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות התקשורת צמיחה ממדגמים ולהוסיף 200 μl של התקשורת תיוג לצבוע היטב כל אחד. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד דוגמאות דוגרים, להכין Hoechst 33342 פתרון מכתים הגרעין של דגימות ידי ערבוב 1 μl של 33,342 Hoechst, trihydrochloride, הידראט (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מים פתרון, פתרון 16.2 מ&quot;מ; בדיקות Invitrogen מולקולרית) בתוך 10 מ&quot;ל של שלמה F-12k . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה ממדגמים כל ולהוסיף 600 μl של הפתרון Hoechst לדלל לטעום כל אחד. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות שלוש פעמים עם 600 μl של שלמה F-12k. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 30 דקות נוספות כדי לאפשר fluorophore מאוגדים לנטרל מתוך התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, לשנות את התקשורת על SNAP-Cell דגימות בפעם האחרונה והמשך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת תאים באמצעות Apotome Zeiss Axiovert 200 מיליון מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. להלןכמה תוצאות נציג דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניאון סטנדרטית של COS-7 תאים חיים כי מביעים SNAP-תג fusions. זו התמונה הראשונה הופעות חיות COS-7 תאים להביע pSNAP-H2B (הגרעיני היסטון) שכותרתו עם Cell-SNAP TMR-Star. PSNAP-H2B לבנות נוצר באמצעות pSNAP-תג (מ &#39;) וקטור. התאים תויגו עם SNAP-Cell Star-TMR במשך 30 דקות ו counterstained עם Hoechst 33342 (כחול) עבור גרעינים. פלואורסצנטי ורוד מדגים את כיסוי של חלבון פלואורסצנטי אדום שבו היסטון קיים בנוסף הקרינה הכחול המציין את הגרעין. הביטוי של החלבון H2B מזוהה בבירור ובקלות. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="איור 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="איור 3" /> איורים 2 ו -3. אלה לצד שתי תמונות להראות לחיות COS-7 תאים transfected transiently עם pSNAP-ADRβ2. תאים תויגו עם Cell-SNAP TMR-Star (אדום) counterstained עם Hoechst 33342 (כחול). PSNAP-ADRβ2 לבנות נוצר באמצעות pSNAP-תג (מ &#39;) וקטור. התאים תויגו עם SNAP-Cell Star-TMR במשך 30 דקות ו counterstained עם Hoechst 33342 (כחול) עבור גרעינים. פלואורסצנטי אדום מעיד על קיומו של שטח פני התא חלבון קולטן ADRB2 תוך כחול פלואורסצנטי מזהה את הגרעין.

<ol>
	<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells.">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP-tag+Technologies:+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function.">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li></ol>

המחברים הם מועסקים על ידי ניו אינגלנד Biolabs שמייצר את ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

ישנם מספר משתנים המשפיעים על התוצאות שנצפו כגון אינטנסיביות, לייזר מיקוד, יכולות הציוד, עדשות השתמשו וכו &#39;photostability של fluorophore קובע כמה מהר את הקרינה חייב להיות בשבי לפני דהייה. שיטה זו של תיוג חלבון צדדי מתאים ליישומים רבים. Snap-תג קליפ תג טכנולוגיות תיוג הספציפי של חלבונים היתוך עם בדיקות סינתטי לאפשר היבטים שונים של תפקוד החלבון, כולל מגוון רחב של תהליכים דינמיים בתאים חיים וב lysates התא. Snap-, קליפ, MCP ו-ACP-תג טכנולוגיות לספק צדדיות פשטות יוצאת דופן הדמיה של חלבונים בתאים חיים קבוע ללימוד חלבונים במבחנה. יצירת לבנות גן יחיד התשואות חלבון היתוך מתויג מסוגל להרכיב הצמדה קוולנטי למגוון של קבוצות פונקציונליות, כולל fluorophores, ביוטין, או חרוזים. החלבון של עניין יש משובטים והביע רק פעם אחת ולאחר מכן את היתוך ניתן להשתמש עם מגוון מצעים ניאון עבור יישומים במורד רבים כגון תיוג חלבון בו זמנית בתוך תאים חיים, לוקליזציה של חלבונים טרנסלוקציה, הדופק לרדוף ניסויים, הפנמה מחקרים קולטן , תא סלקטיבית משטח תיוג, חלבון לנתץ מבחני, גילוי חלבון SDS-PAGE, cytometry זרימה, תפוקה גבוהה מבחני מחייב צלחות microtiter, ניסויים אינטראקציה biosensor, ו סריג מבוססי מבחני מחייב.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CHO-K1 Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CCL-61</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Serum free F-12K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene Nunc Int.</td>
<td>155409</td>
<td>Lot: 100808-8-0</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Molecular Probes</td>
<td>H3570</td>
<td>470519</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transpass V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M2561S</td>
<td>0030709</td>
</tr>
<tr>
<td>Transpass D2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M2554S</td>
<td>0060802</td>
</tr>
<tr>
<td>SNAP-Cell TMR Star</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>S9105S</td>
<td>0010811</td>
</tr>
<tr>
<td>pSNAP-ADBR2 Control Plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N9178S</td>
<td>0010811</td>
</tr>
<tr>
<td>pSNAP-H2B Control Plasmid </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N9179S</td>
<td>0010811</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescent labeling of cos-7 expressing snap-tag fusion proteins for live cell imaging

Snap-תג קליפ תג תיוג מערכות חלבון לאפשר את הקובץ המצורף ספציפי, קוולנטי של מולקולות, כולל צבעי ניאון, לחלבון עניין בתאים חיים. מערכות אלו מציעות מבחר רחב של מצעים פלורסנט אופטימיזציה עבור מגוון רחב של מכשור הדמיה. משובטים לאחר והביע, החלבון מתויג ניתן להשתמש עם מגוון מצעים עבור יישומים רבים במורד הזרם מבלי שיבוט שוב. ישנם שני צעדים באמצעות מערכת זו: שיבוט וביטוי של החלבון של עניין כמו היתוך SNAP-תג, וסימון של התמזגות עם המצע SNAP-התג של בחירה. הצמד תג הוא חלבון קטן מבוסס על אדם O<sup&gt; 6</sup&gt;-Alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), חלבון תיקון דנ&quot;א. Snap-תג ותוויות צבעים מצומדות כדי גואנין או קבוצות עוזב chloropyrimidine באמצעות מקשר בנזיל. בתגובה תיוג, הקבוצה בנזיל להחליף המצע מחוברת קוולנטית לתייג-SNAP. קליפ תג הוא גירסה שונה של תג-SNAP, מהונדסים להגיב benzylcytosine ולא נגזרים benzylguanine. הפועל בשיתוף עם תג-SNAP, CLIP-תג מאפשרת תיוג אורתוגונליים ומשלימים בו זמנית של שני חלבונים בתאים זהים.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging at JoVE.com

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Snap-תג קליפ תג תיוג מערכות חלבון לאפשר את הקובץ המצורף ספציפי, קוולנטי של מולקולות, כולל צבעי ניאון, לחלבון עניין בתאים חיים. משובטים לאחר והביע, החלבון מתויג ניתן להשתמש עם מגוון מצעים עבור יישומים רבים במורד הזרם מבלי שיבוט שוב.

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

תיוג של פלורסנט תסיסנית לב מבנים

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconversion של חלבונים מטוהרים פלורסנט ו Dual-בדיקה אופטי סימון בתאים חיים

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...