Name: fluorescent labeling of cos-7 expressing snap-tag fusion proteins for live cell imaging
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging at JoVE.com

Kai Johnsson Ivan Correa Andreas Brecht Katrin Müentener Chris Noren Luo dom Ming Xu Theodore Davis Salvatore Russello Aihua Zhang Inca Ghosh Elissa Maunus Nicholas Labarthe James MacFarland John Buswell Brenda Desmond James Ellard Don Comb

Chapeamento de células CHO-K1: <ol><li> Adicionar 50-100μl de células CHO-K1 que foram tripsinizados de acordo com protocolos padrão de 6ml de completo F-12K. </li><li> Mix suspensão celular por pipetagem cima e para baixo várias vezes, então alíquota 300 ml de suspensão de células tripsinizados a cada poço de uma câmara estéril 8-Lab-Tek II Chambered lamínula com # 1.5 borosilicato lamela câmaras (Nalgene Nunc Int;. Produto # 155409; Lote: 100808-8-0). </li><li> Incubar as amostras a 37 ° C CO, 5% 2 durante a noite. </li></ol> Transfecção transiente de células CHO-K1 com pSNAP-ADRB2 e pSNAP-H2B: <ol><li> Verifique as câmaras de cultura de células semeadas no dia anterior para procurar densidade celular e da saúde. </li><li> Rótulo o número apropriado de tubos de microcentrífuga. </li><li> Em uma capela de fluxo laminar, configurar misturas complexas transfecção acordo com a tabela de exemplo a seguir, usando 0,3 mg pSNAP-ADBR2 DNA Controle Plasmid ou 0,3 mg de pSNAP-H2B DNA Controle Plasmid, 1 ml de D2 TransPass e 1 ml de TransPass V por reação. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> plasmídeo </td><td> número de reações </td><td> l de soro livre de médio </td><td> mL de D2 TransPass </td><td> mL de TransPass V </td><td> mL de DNA plasmídeo </td><td> mL de D2/reaction TransPass </td><td> mL de TransPass V / reação </td><td> ng de DNA / reação </td><td> DNA conc. (Ng / mL) </td><td> mL de DNA plasmídeo / reação </td></tr><tr><td> SNAP-ADRb2 </td><td> 5 </td><td> 236,5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3,5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472,34 </td><td> 0,7 </td></tr><tr><td> H2B SNAP- </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515,89 </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> Simulado </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Untransfected </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li> Primeiro, misture o soro livre F-12K com o DNA adequado plasmídeo, em seguida, adicione o reagente TransPass Transfection D2, em seguida, adicionar o reagente TransPass Transfection V. Misture bem os componentes pipetando cima e para baixo suavemente várias vezes após a adição de cada reagente. </li><li> Incubar a reação em temperatura ambiente por 30 minutos. </li><li> Durante a incubação, lavar as células uma vez com 600 mL de meio DMEM completo e adicionar 450 mL de meio DMEM completo para cada amostra. </li><li> Adicionar 50 ul da mistura de transfecção complexo para cada amostra, lentamente e de forma gota a gota. </li><li> Incubar as amostras durante a noite a 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> SNAP-Cell Labeling Estrela TMR de células CHO-K1 transitoriamente transfectadas com pSNAP-ADRB2 e pSNAP-H2B: <ol><li> Remova cuidadosamente os meios de comunicação transfecção complexas a partir de cada amostra por sucção a vácuo. Lave as células duas vezes com 600 mL de completo F-12K e substituir a mídia em cada poço com 600 mL de completo F-12K. </li><li> Mix de mídia rotulagem dye, adicionando 995 mL de completo F-12K e 51 mL 0,6 mM SNAP-Cell substrato TMR-Star. A concentração final da SNAP-Cell TMR-Estrela deve ser de 3mm. Pipeta cima e para baixo várias vezes para misturar após a adição de substrato. </li><li> Remova cuidadosamente meios de crescimento a partir de amostras e adicionar 200 mL de mídia rotulagem corante a cada poço. Incubar as amostras a 37 ° C, 5% CO 2 por 30 minutos. </li><li> Enquanto as amostras são incubação, preparar solução Hoechst 33342 para a coloração nuclear das amostras através da mistura de 1 ml de Hoechst 33342, trihydrochloride, tri-hidratado (10 mg / ml solução em água, 16,2 mM solução; Sondas Invitrogen Molecular) em 10 ml de completo F-12K . </li><li> Remova a mídia de todas as amostras e adicionar 600 mL da solução de Hoechst diluir para cada amostra. Incubar as amostras a 37 ° C, 5% CO 2 por 5 minutos. </li><li> Lavar três vezes com amostras de 600 mL de completo F-12K. </li><li> Incubar as amostras a 37 ° C, 5% CO 2 por mais 30 minutos para permitir que fluoróforo unincorporated difundir para fora das células. </li><li> Após 30 minutos, altere os meios de comunicação nas amostras SNAP-Cell, uma última vez e vá para a imagem. </li><li> Imagem as células usando um microscópio Zeiss ApoTome Axiovert 200M fluorescente. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Aqui estãoalguns resultados representativos das imagens fluorescentes por microscopia de fluorescência padrão de viver COS-7 células que estão expressando tag SNAP-fusões. Esta primeira imagem mostra ao vivo COS-7 células que expressam pSNAP-H2B (nuclear histona) marcada com SNAP-Cell TMR-Star. A construção pSNAP-H2B foi gerada usando o tag pSNAP-vetor (m). As células foram marcadas com SNAP-Cell TMR-Estrela por 30 minutos e contrastado com Hoechst 33342 (azul) para núcleos. A fluorescência rosa demonstra a sobreposição da fluorescência vermelha onde a proteína histona está presente, além da fluorescência azul indicando o núcleo. A expressão da proteína H2B é clara e facilmente identificados. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="Figura 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figuras 2 e 3. Essas duas imagens seguintes mostram ao vivo COS-7 transfectadas transitoriamente com células-pSNAP ADRβ2. As células foram marcadas com SNAP-Cell TMR-Star (vermelho) e contrastado com Hoechst 33342 (azul). A construção pSNAP-ADRβ2 foi gerada usando o tag pSNAP-vetor (m). As células foram marcadas com SNAP-Cell TMR-Estrela por 30 minutos e contrastado com Hoechst 33342 (azul) para núcleos. A fluorescência vermelha indica a presença de superfície celular ADRB2 proteína receptora de fluorescência azul, enquanto identifica o núcleo.

<ol>
	<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells.">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP-tag+Technologies:+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function.">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li></ol>

Os autores são empregados por New England Biolabs, que produz os reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

Há diversas variáveis ​​que afetam os resultados observados, tais como foco intensidade do laser, a capacidade de equipamentos, lentes usadas, etc A fotoestabilidade do fluoróforo determina a rapidez com que a fluorescência deve ser capturado antes de desaparecer. Este método de rotulagem proteína é versátil e adequada para muitas aplicações. SNAP-tag e CLIP tag tecnologias para a rotulagem específica de proteínas de fusão com sondas sintéticas permitem vários aspectos da função da proteína, incluindo uma variedade de processos dinâmicos em células vivas e em lisados ​​celulares. SNAP, CLIP, MCP e ACP-tag tecnologias oferecem versatilidade e simplicidade extraordinária para a imagem de proteínas em células vivas e fixos e para o estudo das proteínas in vitro. A criação de uma construção de um único gene produz uma proteína de fusão com a tag capaz de formar uma ligação covalente a uma variedade de grupos funcionais, incluindo fluoróforos, biotina, ou grânulos. A proteína de interesse devem ser clonados e expressos apenas uma vez e, em seguida, a fusão pode ser usado com uma variedade de substratos fluorescentes para diversas aplicações a jusante como a rotulagem de proteína simultânea no interior das células vivas, localização de proteínas e translocação, pulse-chase experimentos, estudos de internalização do receptor , rotulagem superfície seletiva de células, proteínas puxar para baixo os ensaios, a detecção de proteínas em SDS-PAGE, citometria de fluxo, de alto rendimento ensaios de ligação em placas de microtitulação, as experiências de interação biosensor, e FRET baseado em ensaios de ligação.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CHO-K1 Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CCL-61</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Serum free F-12K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene Nunc Int.</td>
<td>155409</td>
<td>Lot: 100808-8-0</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Molecular Probes</td>
<td>H3570</td>
<td>470519</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transpass V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M2561S</td>
<td>0030709</td>
</tr>
<tr>
<td>Transpass D2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M2554S</td>
<td>0060802</td>
</tr>
<tr>
<td>SNAP-Cell TMR Star</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>S9105S</td>
<td>0010811</td>
</tr>
<tr>
<td>pSNAP-ADBR2 Control Plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N9178S</td>
<td>0010811</td>
</tr>
<tr>
<td>pSNAP-H2B Control Plasmid </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N9179S</td>
<td>0010811</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescent labeling of cos-7 expressing snap-tag fusion proteins for live cell imaging

SNAP-tag e CLIP tag-sistemas de rotulagem proteínas permitem o anexo, covalentes de moléculas específicas, incluindo corantes fluorescentes, a uma proteína de interesse em células vivas. Estes sistemas oferecem uma ampla seleção de substratos fluorescentes otimizado para uma faixa de instrumentação de imagem. Uma vez clonado e expresso, a proteína com a tag pode ser usada com uma variedade de substratos para inúmeras aplicações a jusante sem ter de clonar novamente. Há duas etapas para usar este sistema: a clonagem e expressão da proteína de interesse como uma fusão SNAP-tag, e rotulagem da fusão com o substrato SNAP-tag de escolha. O SNAP-tag é uma pequena proteína humana com base em O<sup&gt; 6</sup&gt;-Alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), uma proteína de reparo do DNA. SNAP tag rótulos são corantes conjugado com guanina ou chloropyrimidine grupos deixando através de um linker benzílico. Na reação de rotulagem, o grupo benzila substituído do substrato é covalentemente ligado ao SNAP-tag. CLIP-tag é uma versão modificada do SNAP-tag, projetado para reagir com benzylcytosine ao invés de derivados benzylguanine. Quando usado em conjunto com SNAP-tag, tag-CLIP permite a rotulagem ortogonais e complementares de duas proteínas simultaneamente nas mesmas celas.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging at JoVE.com

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag e CLIP tag-sistemas de rotulagem proteínas permitem o anexo, covalentes de moléculas específicas, incluindo corantes fluorescentes, a uma proteína de interesse em células vivas. Uma vez clonado e expresso, a proteína com a tag pode ser usada com uma variedade de substratos para inúmeras aplicações a jusante sem ter de clonar novamente.

Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biologia

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Imagens de células vivas de F-actina Dynamics via Microscopia fluorescente Speckle (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Labeling fluorescentes de Drosophila Estruturas Coração

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Fotoconversão de proteínas purificadas fluorescentes e Dual-sonda Destacando Optical em células vivas

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Duas e três dimensões imagens de células vivas de Proteínas de DNA resposta a danos

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...