Name: fluorescent labeling of cos-7 expressing snap-tag fusion proteins for live cell imaging
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging at JoVE.com

Кай Джонсон Иван Корреа Андреас Брехта Катрин Müentener Крис Noren Ло ВС Сюй Мин Теодор Дэвис Сальваторе Russello Aihua Чжан Инков Гош Элисса Maunus Николай Лабарт Джеймс Макфарленд Джон Басуэлл Бренда Десмонд Джеймс Эллард Дон Comb

Покрытие CHO-K1 клеток: <ol><li> Добавить 100 мкл 50-СНО-К1 клетки, которые были трипсином в соответствии со стандартными протоколами к 6 мл полной F-12K. </li><li> Смешайте клеточной суспензии с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, затем аликвоту 300 мкл суспензии клеток трипсином в каждую лунку стерильного 8-камера Lab-Tek II патрон покровного стекла с № 1,5 боросиликатного покровного стекла камеры (Nalgene Nunc Int;. Продукт # 155409; Лот: 100808-8-0). </li><li> Инкубируйте образцы при температуре 37 ° C, 5% СО 2 за одну ночь. </li></ol> Переходные Трансфекция CHO-K1 Клетки с pSNAP-ADRB2 и pSNAP-H2B: <ol><li> Проверьте клеточной культуры посеяны камер в предыдущий день, чтобы искать плотность клеток и здоровья. </li><li> Этикетка соответствующее количество микроцентрифужную труб. </li><li> В ламинарном боксе, созданный трансфекции сложных смесей в соответствии со следующей таблицей образца, используя или 0,3 мкг pSNAP-ADBR2 управления плазмидной ДНК или 0,3 мкг pSNAP-H2B управления плазмидной ДНК, 1 мкл TransPass D2 и 1 мкл TransPass V в реакции. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> плазмида </td><td> число реакций </td><td> мкл бессывороточной среде </td><td> мкл TransPass D2 </td><td> мкл TransPass V </td><td> мкл ДНК плазмиды </td><td> мкл TransPass D2/reaction </td><td> мкл TransPass В / реакции </td><td> нг ДНК / реакции </td><td> ДНК конц. (Нг / мкл) </td><td> мкл ДНК плазмиды / реакции </td></tr><tr><td> SNAP-ADRb2 </td><td> 5 </td><td> 236,5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3,5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472,34 </td><td> 0,7 </td></tr><tr><td> H2B-SNAP </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515,89 </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> Макет </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Untransfected </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li> Во-первых, смесь сыворотки F-12K с соответствующим плазмидной ДНК, а затем добавить TransPass D2 реагентов трансфекции, а затем добавить Трансфекция TransPass V реагентов. Смешайте компоненты и с помощью пипетки вверх и вниз, мягко несколько раз после добавления каждого реактива. </li><li> Инкубируйте реакции при комнатной температуре в течение 30 минут. </li><li> Во время инкубации, мыть клетки один раз с 600 мкл полной DMEM и добавить 450 мкл полной DMEM к каждому образцу. </li><li> Добавить 50 мкл трансфекции сложную смесь для каждого образца, медленно и по каплям моды. </li><li> Инкубируйте образцы ночи при 37 ° C, 5% СО 2. </li></ol> SNAP-Cell ПМР Звезда Маркировка СНО-К1 клетки Временно трансфицированных pSNAP-ADRB2 и pSNAP-H2B: <ol><li> Осторожно снимите трансфекции комплексом средств массовой информации из каждого образца вакуумного отсоса. Вымойте клетки в два раза с 600 мкл полной F-12K и заменить средства массовой информации в каждую лунку с 600 мкл полной F-12K. </li><li> Смешайте СМИ красителя маркировки, добавив 995 мкл полной F-12K и 51 мкл 0,6 мМ SNAP-Cell TMR-Star подложки. Конечная концентрация SNAP-Cell TMR-звезда должна быть 3 мм. Внесите вверх и вниз несколько раз, чтобы смесь после добавления субстрата. </li><li> Осторожно снимите питательной среды из образцов и добавить 200 мкл красителя СМИ маркировки в каждую лунку. Инкубируйте образцы при температуре 37 ° C, 5% СО 2 в течение 30 минут. </li><li> Хотя образцы инкубации, подготовить Hoechst 33342 решением для ядерных окрашивания образцов путем смешивания 1 мкл Hoechst 33342, тригидрохлорид, тригидрат (10 мг / мл раствора в воде, 16,2 мМ раствора; Invitrogen молекулярных проб) в 10 мл полной F-12K . </li><li> Выньте материал из всех образцов и добавить 600 мкл разбавленного раствора Hoechst к каждому образцу. Инкубируйте образцы при температуре 37 ° C, 5% СО 2 в течение 5 минут. </li><li> Вымойте образцы три раза с 600 мкл полной F-12K. </li><li> Инкубируйте образцы при температуре 37 ° C, 5% СО 2 в течение дополнительных 30 минут, чтобы дать неинкорпорированных флуорофора диффундировать из клетки. </li><li> Через 30 минут, изменение средств массовой информации на SNAP-Cell образцы в последний раз и переходите к визуализации. </li><li> Изображение клетки с использованием Zeiss Apotome Axiovert 200M флуоресцентного микроскопа. </li></ol> Представитель Результаты <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Вотнекоторые показательные результаты флуоресцентной визуализации с использованием стандартных флуоресцентной микроскопии живых COS-7 клетки, которые выражают SNAP-теги слияний. Это первое изображение показывает жить COS-7 клетках, экспрессирующих pSNAP-H2B (ядерных гистонов) помечены SNAP-Cell TMR-Star. PSNAP-H2B построить, создан с помощью pSNAP-теги (м) вектор. Клетки были помечены SNAP-Cell TMR-Star в течение 30 минут и контрастно с Hoechst 33342 (синий) для ядер. Розовый флуоресценции демонстрирует наложение красной флуоресценции гистонов, где белок присутствует в дополнение к синей флуоресценции указывает ядру. Экспрессии белка H2B четко и легко определить. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> На рисунках 2 и 3. Следующие две картинки показывают жить COS-7 клетки временно трансфицированных pSNAP-ADRβ2. Клетки были помечены SNAP-Cell TMR-Star (красный) и контрастно с Hoechst 33342 (синий). PSNAP-ADRβ2 построить, создан с помощью pSNAP-теги (м) вектор. Клетки были помечены SNAP-Cell TMR-Star в течение 30 минут и контрастно с Hoechst 33342 (синий) для ядер. Красной флуоресценции указывает на присутствие на поверхности клеток ADRB2 рецепторного белка в то время как синяя флуоресценция идентифицирует ядро.

<ol>
	<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells.">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP-tag+Technologies:+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function.">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li></ol>

Авторы являются сотрудниками Новой Англии Биолабс, который производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.

Есть несколько факторов, влияющих на результаты наблюдений, таких как фокус, интенсивность лазерного излучения, оборудование возможностей, используемого объектива и т.д. фотостабильность флуорофора определяет, насколько быстро флуоресценции должно быть захвачен был утрачен. Такой способ маркировки белка является универсальным и подходит для многих приложений. SNAP-теги и CLIP-теги технологий для конкретной маркировки белков слияния с синтетическими зондов позволяют различным аспектам функции белка, в том числе различные динамические процессы в живых клетках и в клеточных лизатов. SNAP-, CLIP-, MCP-и ACP-теги технологии обеспечивают простоту и чрезвычайных универсальность визуализации белков в живых и фиксированных клеток и изучение белков в лабораторных условиях. Создание единого построить ген дает меткой гибридный белок способен образовывать ковалентную связь с различными функциональными группами, в том числе флуорофоров, биотин, или бусы. Белок должен быть клонированы и выразил только один раз и затем синтез можно использовать с различными флуоресцентными субстраты для многочисленных вниз по течению приложений, таких как одновременная маркировка белка внутри живых клеток, локализация белка и транслокации, широтно-погони эксперименты, исследования рецепторов интернализации , селективный маркировки поверхности клеток, белка выпадающем анализы, белок обнаружения в SDS-PAGE, проточной цитометрии, высокой пропускной обязательные анализы в микротитровальных пластин, биосенсор экспериментов взаимодействия, и FRET основе обязательных анализов.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CHO-K1 Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CCL-61</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Serum free F-12K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene Nunc Int.</td>
<td>155409</td>
<td>Lot: 100808-8-0</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Molecular Probes</td>
<td>H3570</td>
<td>470519</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transpass V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M2561S</td>
<td>0030709</td>
</tr>
<tr>
<td>Transpass D2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M2554S</td>
<td>0060802</td>
</tr>
<tr>
<td>SNAP-Cell TMR Star</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>S9105S</td>
<td>0010811</td>
</tr>
<tr>
<td>pSNAP-ADBR2 Control Plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N9178S</td>
<td>0010811</td>
</tr>
<tr>
<td>pSNAP-H2B Control Plasmid </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N9179S</td>
<td>0010811</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescent labeling of cos-7 expressing snap-tag fusion proteins for live cell imaging

SNAP-теги и CLIP-теги системах белка маркировки позволяют конкретные, ковалентного присоединения молекул, в том числе флуоресцентные краски, белок в живых клетках. Эти системы предлагают широкий выбор флуоресцентных субстратов оптимизированы для диапазона изображения приборов. После клонирован и выражен, помеченный белок может использоваться с различными субстратами для многочисленных приложений вниз по течению, не имея для клонирования снова. Существуют два шага, чтобы с помощью этой системы: клонирование и экспрессия белка интерес как SNAP-теги фьюжн, и маркировка слияния с SNAP-теги субстрат выбора. SNAP-тег небольшой белок, основанные на человеческих O<sup&gt; 6</sup&gt;-Alkylguanine-ДНК-alkyltransferase (hAGT), белок репарации ДНК. SNAP-теги метки красителей конъюгированных с гуанин или хлорпиримидин уходящих групп через бензил компоновщика. В маркировке реакции, замещенный бензил группа субстрат ковалентно связаны с SNAP-тегов. CLIP-тег модифицированную версию SNAP-тег, спроектирован, чтобы вступать в реакцию с benzylcytosine, а не benzylguanine производных. При использовании в сочетании с SNAP-теги, CLIP-тегов позволяет ортогональные и дополнительные маркировки двух белков одновременно в том же клеток.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging at JoVE.com

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-теги и CLIP-теги системах белка маркировки позволяют конкретные, ковалентного присоединения молекул, в том числе флуоресцентные краски, белок в живых клетках. После клонирован и выражен, помеченный белок может использоваться с различными субстратами для многочисленных приложений вниз по течению, не имея для клонирования снова.

Флуоресцентная маркировка COS-7 выражая SNAP-теги Белки Fusion для живых изображений сотовый

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Маркировка стволовых клеток с флуоресцентными красителями для неинвазивного обнаружения оптических изображений с

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Живая изображений Сотовые Ф-актина Динамика через Флуоресцентный Спекл микроскопия (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Флуоресцентная маркировка Drosophila Структур сердца

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Трансплантация GFP-экспрессирующих бластомеров для живых изображений сетчатки и мозга развития в химерические эмбрионов данио рерио

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Фотопревращения Очищенная флуоресцентных белков и двойного зонда Оптические Выделение в живых клетках

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Двух-и трехмерных изображений живых клеток ДНК, белков реакции на повреждения

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Жить Визуализация GFP-меченых белков в<em&gt; Drosophila</em&gt; Ооцитов

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Живая съемка апоптоза клеток во время акции<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбриогенеза

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Прижизненные микроскопия для визуализации субклеточных структур в живых мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Выражение флуоресцентные синтез белков в мышиных костного мозга-производные дендритные клетки и макрофаги

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...