Name: fluorescent labeling of cos-7 expressing snap-tag fusion proteins for live cell imaging
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging at JoVE.com

Kai Johnsson Ivan Correa Andreas Brecht Katrin Müentener Chris Noren Luo sön Ming Xu Theodore Davis Salvatore Russello Aihua Zhang Inca Ghosh Elissa Maunus Nicholas Labarthe James MacFarland John Buswell Brenda Desmond James Ellard Don Comb

Plätering CHO-K1 Celler: <ol><li> Tillsätt 50-100μl av CHO-K1 celler som har trypsinized enligt standardprotokoll till 6 ml av kompletta F-12K. </li><li> Blanda cellsuspension genom att pipettera upp och ned flera gånger och sedan alikvot 300 ìl trypsinized cellsuspension i varje brunn på en steril 8-kammare Lab-Tek II Chambered Coverglass med # 1,5 borosilikat coverglass kammare (Nalgene Nunc int;. Produkt # 155.409; Vara: 100808-8-0). </li><li> Inkubera prov vid 37 ° C, 5% CO 2 över en natt. </li></ol> Övergående transfektion av CHO-K1 Celler med pSNAP-ADRB2 och pSNAP-H2B: <ol><li> Kontrollera kamrarna cellodling seedade dagen innan för att leta efter celltätheten och hälsa. </li><li> Etikett lämpligt antal mikrofugrör rör. </li><li> I ett laminärt flöde huva, inrättat transfektion komplexa blandningar enligt följande exempel diagram, med antingen 0,3 mikrogram pSNAP-ADBR2 Kontroll Plasmid DNA eller 0,3 mikrogram pSNAP-H2B Kontroll Plasmid DNA, 1 ìl TransPass D2 och 1 l av TransPass V per reaktion. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> plasmid </td><td> antal reaktioner </td><td> l av serum-fria medel </td><td> ìl TransPass D2 </td><td> ìl TransPass V </td><td> ìl av plasmid-DNA </td><td> ìl TransPass D2/reaction </td><td> ìl TransPass V / reaktion </td><td> ng DNA / reaktion </td><td> DNA-konc. (Ng / l) </td><td> ìl av plasmid-DNA / reaktion </td></tr><tr><td> SNAP-ADRb2 </td><td> 5 </td><td> 236,5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3,5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472,34 </td><td> 0,7 </td></tr><tr><td> H2B-SNAP </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515,89 </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> Mock </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Untransfected </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li> Först, blanda serum fria F-12K med lämplig plasmid-DNA, tillsätt sedan TransPass D2 Transfektion Reagens, tillsätt sedan TransPass V Transfektion reagens. Blanda komponenterna och genom att pipettera upp och ned försiktigt flera gånger efter tillsats av varje reagens. </li><li> Inkubera reaktionen vid rumstemperatur i 30 minuter. </li><li> Under inkubation, tvätta cellerna en gång med 600 l av kompletta DMEM och tillsätt 450 l av kompletta DMEM till varje prov. </li><li> Tillsätt 50 ìl av transfektion komplexa blandningen till varje prov, långsamt och i en droppvis mode. </li><li> Inkubera proverna över natten vid 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> SNAP-Cell TMR Star-märkning av CHO-K1-celler övergående transfererats med pSNAP-ADRB2 och pSNAP-H2B: <ol><li> Ta försiktigt bort transfektion komplexa media från varje prov med vakuum. Tvätta cellerna två gånger med 600 l av komplett F-12K och ersätta media i varje brunn med 600 l av komplett F-12K. </li><li> Blanda färg märkning medierna genom att tillsätta 995 l av komplett F-12K och 51 l 0,6 mm snap-Cell TMR-Star substrat. Den slutliga koncentrationen av SNAP-Cell TMR-stjärna ska vara 3 mm. Pipettera upp och ned flera gånger för att blanda efter tillsats av substrat. </li><li> Ta försiktigt bort tillväxten media från prover och tillsätt 200 l färgämne märkning media till varje brunn. Inkubera prov vid 37 ° C, 5% CO 2 i 30 minuter. </li><li> Medan proverna ruva, förbereda Hoechst 33.342 lösning för nukleär färgning av prover genom att blanda 1 ìl Hoechst 33.342, trihydrochloride, trihydrat (10 mg / ml lösning i vatten, 16,2 mm lösning; Invitrogen molekylära sonder) i 10 ml komplett F-12K . </li><li> Ta bort materialet från alla prover och tillsätt 600 l av de utspädda Hoechst lösning till varje prov. Inkubera prov vid 37 ° C, 5% CO 2 i 5 minuter. </li><li> Tvätta prover tre gånger med 600 l av komplett F-12K. </li><li> Inkubera proverna vid 37 ° C, 5% CO 2 i ytterligare 30 minuter så att oregistrerade fluoroforen att sprida ut ur cellerna. </li><li> Efter 30 minuter ändra media på den SNAP-cellprover en sista gång och gå vidare till bildbehandling. </li><li> Bild cellerna med hjälp av en Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescerande mikroskop. </li></ol> Representativa resultat <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Här ärnågra representativa resultat av fluorescerande avbildning med hjälp av vanliga fluorescerande mikroskopi av levande COS-7 celler som uttrycker SNAP-taggen fusioner. Denna första bild visar leva COS-7 celler som uttrycker pSNAP-H2B (nukleära histoner) märkt med SNAP-Cell TMR-Star. Den pSNAP-H2B konstruera genererades med pSNAP-taggen (m) vektor. Cellerna var märkta med SNAP-Cell TMR-Star i 30 minuter och counterstained med Hoechst 33.342 (blå) för kärnor. Den rosa fluorescens visar en överlagring av röda fluorescens där histon protein finns i tillägg till den blå fluorescens som visar kärnan. Uttrycket för H2B protein är tydligt och lätt att identifiera. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="Figur 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 2 och 3. Dessa två bilder visar leva COS-7 celler övergående transfekterade med pSNAP-ADRβ2. Celler märkta med SNAP-Cell TMR-Star (röd) och counterstained med Hoechst 33.342 (blå). Den pSNAP-ADRβ2 konstruera genererades med pSNAP-taggen (m) vektor. Cellerna var märkta med SNAP-Cell TMR-Star i 30 minuter och counterstained med Hoechst 33.342 (blå) för kärnor. Den röda fluorescensen indikerar förekomst av cellyteproteiner protein ADRB2 medan blå fluorescens identifierar kärnan.

<ol>
	<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells.">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP-tag+Technologies:+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function.">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li></ol>

Författarna är anställda av New England Biolabs som producerar de reagenser och instrument som används i denna artikel.

Det finns flera variabler som påverkar observerade resultat som fokus, laser intensitet, utrustning kapacitet, objektiv etc. fotostabilitet av fluoroforen bestämmer hur snabbt fluorescens fångas innan de bleknar. Denna metod för protein märkning är mångsidig och lämplig för många applikationer. SNAP-tag och clip-tagg teknik för särskild märkning av fusionsproteiner med syntetiska sonder att olika aspekter av proteiners funktion, bl.a. olika typer av dynamiska processer i levande celler och i cell lysates. SNAP-, CLIP-, MCP-och AVS-taggen teknik ger enkelhet och extra mångsidighet till avbildning av proteiner i levande och fasta celler och till studiet av proteiner in vitro. Skapandet av en enda gen konstruktion ger en taggad fusionsprotein i stånd att bilda ett kovalent koppling till en rad olika funktionella grupper, däribland fluoroforer, biotin, eller pärlor. Proteinet av intresse måste klonas och uttryckte bara en gång och sedan fusion kan användas med en rad olika fluorescerande substrat för många nedströms applikationer såsom samtidiga protein märkning inuti levande celler, protein lokalisering och translokation, puls-jakt experiment, receptor internalisering studier , selektiv cellytan märkning, protein dra ner analyser, protein upptäckt i SDS-PAGE, flödescytometri, med hög genomströmning bindande tester på mikrotiterplattor, Biosensor experiment interaktion och FRET-baserade bindande analyser.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CHO-K1 Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CCL-61</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Serum free F-12K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene Nunc Int.</td>
<td>155409</td>
<td>Lot: 100808-8-0</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Molecular Probes</td>
<td>H3570</td>
<td>470519</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transpass V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M2561S</td>
<td>0030709</td>
</tr>
<tr>
<td>Transpass D2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M2554S</td>
<td>0060802</td>
</tr>
<tr>
<td>SNAP-Cell TMR Star</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>S9105S</td>
<td>0010811</td>
</tr>
<tr>
<td>pSNAP-ADBR2 Control Plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N9178S</td>
<td>0010811</td>
</tr>
<tr>
<td>pSNAP-H2B Control Plasmid </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N9179S</td>
<td>0010811</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescent labeling of cos-7 expressing snap-tag fusion proteins for live cell imaging

SNAP-tag och clip-taggen protein märkningssystem aktivera specifika, kovalent bindning av molekyler inklusive fluorescerande färger, till ett protein av intresse i levande celler. Dessa system erbjuder ett brett urval av fluorescerande substrat optimerade för en rad imaging instrumentering. När klonade och uttryckt kan taggade proteinet användas med en mängd av substrat för många efterföljande program utan att behöva klona igen. Det finns två steg för att använda detta system: kloning och uttryck av proteinet av intresse som ett SNAP-tagg fusion, och märkning av fusion med SNAP-taggen substrat val. Den SNAP-taggen är ett litet protein som bygger på mänskliga O<sup&gt; 6</sup&gt;-Alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), en DNA-reparation protein. SNAP-tagg etiketter färgämnen konjugerade med guanin eller chloropyrimidine lämnar grupper via en bensyl länkare. I märkningen reaktionen är ersatt bensyl grupp av underlaget kovalent bifogas SNAP-taggen. CLIP-tagg är en modifierad version av SNAP-taggen, konstruerade för att reagera med benzylcytosine snarare än benzylguanine derivat. När den används tillsammans med SNAP-taggen gör CLIP-tagga ortogonala och kompletterande märkning av två proteiner samtidigt i samma celler.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging at JoVE.com

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag och clip-taggen protein märkningssystem aktivera specifika, kovalent bindning av molekyler inklusive fluorescerande färger, till ett protein av intresse i levande celler. När klonade och uttryckt kan taggade proteinet användas med en mängd av substrat för många efterföljande program utan att behöva klona igen.

Fluorescerande märkning av COS-7 uttrycka SNAP-tagg fusionsproteiner för levande cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Märkning stamceller med fluorescerande färger för icke-invasiv Detection med optisk avbildning

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Levande cell imaging av F-aktin Dynamics via Fluorescent Speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescerande märkning av Drosophila Heart strukturer

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplantation av GFP-uttryckande blastomerer för Live avbildning av näthinnan och hjärnans utveckling hos chimära Zebrafish embryon

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconversion renat fluorescerande proteiner och Dual-probe optisk markering i levande celler

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Två-och tredimensionell levande cell imaging av svar DNA-skador Proteiner

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live avbildning av GFP-märkta proteiner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocyter

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital Mikroskopi för Imaging subcellulära strukturer i levande möss som uttrycker fluorescerande proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Uttryck för fluorescerande fusionsproteinerna i murina benmärg-derived dendritiska celler och makrofager

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...