Name: time-lapse imaging of mitosis after sirna transfection
Uploaded: 2010-06-06T18:00:00
Duration: 8 min 21 s
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इस काम अमेरिकन कैंसर सोसायटी (पीएफ-07-103-01-CSM), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (GM61275 R01 और CA042014 p30), लेकिमिया और लिंफोमा सोसाइटी, और व्याध कैंसर फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.

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	<li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis.">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression.">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li><li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy.">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li><li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells.">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li><li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC/C(Cdc20)+in+interphase.">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li><li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation.">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li><li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina.">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li><li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy.">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li><li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization.">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li><li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling.">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li><li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells.">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li><li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities.">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li></ol>

इमेजिंग और फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रौद्योगिकी में हाल के अग्रिमों के साथ, जी इमेजिंग सेलुलर विश्लेषण 2 के एक नियमित पहलू बन गया है . GFP की एक किस्म (और अन्य रंग वेरिएंट 3) टैग प्रोटीन व्यापक रूप से उपलब्ध है या अपेक्षाकृत आसान करने के लिए निर्माण कर रहे हैं और डीएनए गुणसूत्र / 4 गतिशीलता, 5, centrosome 6 दोहराव, cyclin बी गतिशीलता सहित कोशिका विभाजन पहचान का एक संख्या ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 7, परमाणु लिफाफा टूटने और reassembly 8, 9, mitotic धुरा 10 गठन, और 11 cytokinesis के विभिन्न चरणों. टैग की गईं प्रोटीन अकेले या संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है जब फ्लोरोसेंट टैग के स्पेक्ट्रा / उत्तेजना उत्सर्जन संगत कर रहे हैं, अनुमति विशिष्ट घटनाओं के बीच समन्वय मूल्यांकन किया. यदि अधिक से अधिक स्थानिक और / या अस्थायी संकल्प है / वांछित हैं, confocal माइक्रोस्कोपी कि लेजर स्कैनिंग, कताई डिस्क, या प्रतिध्वनि स्कैनिंग इस्तेमाल किया जा सकता है, और बढ़ती संकल्प के साथ परिष्कृत माइक्रोस्कोपी विकल्पों की सूची बढ़ने के लिए जारी है. स्तनधारी कोशिकाओं में समसूत्री विभाजन की लाइव इमेजिंग भी उच्च throughput आरएनएआई और छोटे अणु स्क्रीन 12-14 में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया गया है है. इस प्रकार, जबकि एक प्रारंभिक प्रयोगों इस तकनीक का उपयोग अपेक्षाकृत आसान हो सकता है है, इस रणनीति पर निर्माण के लिए संभावनाएं व्यापक हैं.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13778-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>12-565-337</td>
<td>Additional chamber sizes are available</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F1141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stage-top cell incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OKO Lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>Automated inverted fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate microscope</td>
</tr>
<tr>
<td>Software package</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Metamorph</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate software</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

time-lapse imaging of mitosis after sirna transfection

सेलुलर संगठन और गुणसूत्र गतिशीलता है कि पिंजरे का बँटवारा दौरान होने में परिवर्तन कसकर जीनोमिक और सेलुलर सामग्री की सटीक इनहेरीटेंस सुनिश्चित करने के लिए समन्वय कर रहे हैं. समसूत्री विभाजन की पहचान की घटनाओं, जैसे गुणसूत्र आंदोलन एक व्यक्ति सेल विशिष्ट GFP टैग प्रोटीन व्यक्त स्तनधारी सेल लाइनों के समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के आधार पर आसानी से लगाया जा सकता है है. आरएनएआई आधारित रिक्तीकरण के साथ संयोजन में, इस पिंजरे का बँटवारा जहां दोष होते हैं, के बाद एक विशेष प्रोटीन का स्तर कम किया गया है (ओं) की अवस्था pinpointing के लिए एक शक्तिशाली तरीका हो सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम समसूत्री विभाजन के समय पर एक संभावित mitotic नियामक प्रोटीन घट के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक बुनियादी तरीका मौजूद है. कक्ष siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं, ऊष्मायन चरण शीर्ष चैम्बर में रखा, और एक स्वचालित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग imaged. हम वर्णन कैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए समय चूक प्रयोग, छवि दृश्यों की प्रक्रिया करने के लिए या तो अभी भी छवि montages या फिल्में बनाने के लिए सेट है, और कैसे और यों mitotic एक सेल लाइन का उपयोग कर व्यक्त चरणों के समय विश्लेषण mCherry - टैग histone H2B. अंत में, हम एक समय चूक प्रयोग की डिजाइनिंग के लिए महत्वपूर्ण विचार पर चर्चा की. इस रणनीति के अन्य तरीकों के लिए पूरक है और 1 के लाभ प्रदान करता है) कैनेटीक्स में परिवर्तन है कि जब सेल चक्र का उपयोग कर दवा उपचार सिंक्रनाइज़ करने के लिए आवश्यकता के बिना जनसंख्या और पिंजरे का बँटवारा के दो विश्लेषण) के रूप में कोशिकाओं को देख नहीं देखा जा सकता है संवेदनशीलता. ऐसे इमेजिंग प्रयोगों से दृश्य जानकारी न केवल समसूत्री विभाजन के उप - चरणों का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है, लेकिन यह भी अप्रत्याशित अंतर्दृष्टि है कि FACS द्वारा कोशिका चक्र विश्लेषण से स्पष्ट नहीं किया जाएगा प्रदान कर सकते हैं.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

यहाँ हम छवि के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन और mitotic समय रहते siRNA अभिकर्मक के बाद स्तनधारी टिशू कल्चर कोशिकाओं के यों.

SiRNA अभिकर्मक के बाद समय चूक सूत्रीविभाजन की इमेजिंग

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Research

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