Name: two-photon-based photoactivation in live zebrafish embryos
Uploaded: 2010-12-24T15:00:00
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Dank gebührt Genia Brodsky für Bild-Grafikprozessor; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, und Leonid Roitman für technische Beratung und Unterstützung bei der Zwei-Photonen-Uncaging; Maayan Tahor und Suliman Elsadin für technische Hilfe, Uwe Strähle für die freundliche Bereitstellung der neurogenin1 Reporter Linie und Amos Gutnick für Kommentare zu diesem Manuskript. Israel Science Foundation (Grant-Nummer 928/08) und die Harriet &amp; Marcel Dekker Foundation; Die Forschung in der Levkowitz Labor wird durch die Deutsch-Israelische Stiftung (Förderkennzeichen 183/2007) unterstützt. GL ist ein Inhaber des Tauro Career Development Lehrstuhls für Biomedizinische Forschung.

Wir beschreiben ein Protokoll der Markierung von Zellen mit Käfig Fluorescein, können jedoch auch andere photoaktivierbare Farbstoffe und Proteine ​​in ähnlicher Weise verwendet werden. 1. Die Injektion von Caged Fluorescein <ol><li> Bereiten Sie 5% Stammlösung (5mg Käfig-Fluorescein / 100 ul 0,2 M KCl) von Dextran-konjugierten 4,5-Dimethoxy-2-Nitrobenzyl (DMNB) caged Fluorescein (10.000 MW Dextran, anionische, Invitrogen, molekulare Sonden, Carlsbad, CA , cat. Nr. D-3310). Aliquo...

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+(Brachydanio+rerio.">The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio.</a> , (1995).</li><li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon.">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li><li>Russek-Blum, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neuronal+cluster+size+is+determined+during+early+forebrain+patterning.">Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning.</a> Development. 135, 3401-3413 (2008).</li><li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein.">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li><li>Staudt, N., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Prethalamus+Is+Established+during+Gastrulation+and+Influences+Diencephalic+Regionalization.">The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization.</a> PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li><li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein.">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Bulina, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromophore-assisted+light+inactivation+(CALI)+using+the+phototoxic+fluorescent+protein+KillerRed.">Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed.</a> Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).</li><li>Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+cell+chemistry+with+caged+compounds.">Controlling cell chemistry with caged compounds.</a> Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).</li><li>Wieboldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+precursors+of+glutamate:+synthesis,+photochemical+properties,+and+activation+of+glutamate+receptors+on+a+microsecond+time+scale.">Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).</li><li>Marque, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+caged+neurotransmitters.">Using caged neurotransmitters.</a> Nature. 337, 583-584 (1989).</li><li>Zucker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photorelease+techniques+for+raising+or+lowering+intracellular+Ca2.">Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2.</a> Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).</li><li>Neveu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+caged+retinoic+acid+for+one-+and+two-photon+excitation+in+zebrafish+embryos.">A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).</li><li>Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-controlled+gene+silencing+in+zebrafish+embryos.">Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos.</a> Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nat Genet. 28, 317-325 (2001).</li></ol>

Foto-aktivierbaren Verbindungen sind Moleküle, deren Funktion es ist maskiert, bis sie mit einer bestimmten Wellenlänge (in der Regel UV), induzieren eine photochemische Reaktion, dass die Moleküle umgewandelt in eine biologisch oder chemisch aktiven Zustand sind beleuchtet. Diese Sonden liefern eine sehr mächtige Werkzeuge in der zellbiologischen Forschung, da die Aktivierung genau gesteuert werden zeitlich und räumlich durch die Begrenzung ihrer Belichtung. Der wesentliche Vorteil der...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-3310</td>
<td>molecular probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose for injection trough and coated plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9539</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pneumatic picopump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>PV820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>22290-9</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose for embryo mounting</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra Pure LMP agarose</td>
<td>16520100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426338910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fast Red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11496549001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

two-photon-based photoactivation in live zebrafish embryos

Photoaktivierung von Zielverbindungen in einem lebenden Organismus hat ein wertvoller Ansatz erwiesen, um verschiedene biologische Prozesse wie der embryonalen Entwicklung, zelluläre Signalwege und Erwachsenen Physiologie zu untersuchen. In dieser Hinsicht ermöglicht die Verwendung von Multi-Photonen-Mikroskopie quantitative Photoaktivierung von einem bestimmten Licht reagieren Agenten in tiefe Gewebe auf einer einzigen Zelle Auflösung. Als Zebrafischembryonen optisch transparent sind, kann ihre Entwicklung in vivo beobachtet werden. Diese Eigenschaften machen den Zebrafisch einen perfekten Modell-Organismus für die Steuerung der Aktivität einer Vielzahl von chemischen Stoffen und Proteine, die durch konzentriertes Licht. Hier beschreiben wir den Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie, um die Aktivierung von chemisch Käfig Fluorescein, was wiederum ermöglicht es uns, Zell-Schicksal in lebenden Zebrafisch-Embryonen folgen zu induzieren. Wir verwenden Embryonen Ausdruck einer Live-genetische Wahrzeichen (GFP) zu lokalisieren und zielgenauer alle Zellen von Interesse. Dieses Verfahren kann in ähnlicher Weise für präzise Licht induzierte Aktivierung von Proteinen, Hormonen, kleinen Molekülen und anderen Käfig-Verbindungen verwendet werden.

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Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Mehrphotonenmikroskopie ermöglicht die Steuerung von Photonen niedriger Energie mit tiefen optischen Durchbruch und geringere Phototoxizität. Wir beschreiben den Einsatz dieser Technologie für Live-Cell-Kennzeichnung in Zebrafisch-Embryonen. Dieses Protokoll kann leicht für die Foto-Induktion verschiedener Licht-responsive Moleküle angepasst werden.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Forschung

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging Glykane in Zebrafisch-Embryonen durch metabolische Markierung und Bioorthogonale Click-Chemie

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...