Name: two-photon-based photoactivation in live zebrafish embryos
Uploaded: 2010-12-24T15:00:00
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Agradecimentos são devidos a Genia Brodsky para a figura de gráficos; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, e Leonid Roitman para aconselhamento e assistência técnica com o uncaging dois fótons; Maayan tahor e Suliman Elsadin de assistência técnica; Uwe Strahle por ter gentilmente cedido a linha de repórter e neurogenin1 Amos Gutnick para comentários a este manuscrito. A pesquisa no laboratório Levkowitz é apoiado pela Fundação Alemã-Israelense (concessão número 183/2007); Israel Science Foundation (Grant número 928/08) e da Harriet &amp; Marcel Dekker Foundation. GL é um titular da Cátedra de Desenvolvimento de Carreira Tauro em Investigação Biomédica.

Nós descrevemos um protocolo de rotulagem célula usando a fluoresceína enjaulado, no entanto, outros foto-ativável corantes e as proteínas podem ser igualmente utilizados. 1. A injeção de fluoresceína Caged <ol><li> Preparar a solução estoque de 5% (5mg enjaulado-fluoresceína / 100 mL de KCl 0,2 M) de Dextran-conjugado 4,5-dimetoxi-2-nitrobenzyl (DMNB) enjaulado fluoresceína (10.000 MW dextran, aniônicos, Invitrogen, sondas moleculares, Carlsbad, CA , cat. não. D-3310). Alíq...

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+(Brachydanio+rerio.">The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio.</a> , (1995).</li><li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon.">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li><li>Russek-Blum, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neuronal+cluster+size+is+determined+during+early+forebrain+patterning.">Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning.</a> Development. 135, 3401-3413 (2008).</li><li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein.">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li><li>Staudt, N., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Prethalamus+Is+Established+during+Gastrulation+and+Influences+Diencephalic+Regionalization.">The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization.</a> PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li><li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein.">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Bulina, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromophore-assisted+light+inactivation+(CALI)+using+the+phototoxic+fluorescent+protein+KillerRed.">Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed.</a> Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).</li><li>Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+cell+chemistry+with+caged+compounds.">Controlling cell chemistry with caged compounds.</a> Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).</li><li>Wieboldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+precursors+of+glutamate:+synthesis,+photochemical+properties,+and+activation+of+glutamate+receptors+on+a+microsecond+time+scale.">Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).</li><li>Marque, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+caged+neurotransmitters.">Using caged neurotransmitters.</a> Nature. 337, 583-584 (1989).</li><li>Zucker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photorelease+techniques+for+raising+or+lowering+intracellular+Ca2.">Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2.</a> Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).</li><li>Neveu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+caged+retinoic+acid+for+one-+and+two-photon+excitation+in+zebrafish+embryos.">A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).</li><li>Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-controlled+gene+silencing+in+zebrafish+embryos.">Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos.</a> Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nat Genet. 28, 317-325 (2001).</li></ol>

Foto-ativável compostos são moléculas cuja função é mascarado, até que são iluminados com um comprimento de onda específico (geralmente UV), induzindo uma reação fotoquímica que converte as moléculas em um estado biologicamente ou quimicamente ativas. Essas sondas fornecem ferramentas muito poderosas na investigação em biologia celular, uma vez que a ativação pode ser controlado com precisão temporal e espacialmente, limitando a sua exposição à luz. A vantagem significat...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-3310</td>
<td>molecular probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose for injection trough and coated plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9539</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pneumatic picopump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>PV820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>22290-9</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose for embryo mounting</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra Pure LMP agarose</td>
<td>16520100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426338910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fast Red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11496549001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

two-photon-based photoactivation in live zebrafish embryos

Fotoativação de compostos alvo em um organismo vivo tem se mostrado uma abordagem valiosa para investigar vários processos biológicos, tais como o desenvolvimento embrionário, sinalização celular e fisiologia adulta. A este respeito, o uso de microscopia multi-fotão permite fotoativação quantitativa de um determinado agente luz responsivo em tecidos profundos em uma resolução única célula. Como embriões zebrafish são opticamente transparentes, o seu desenvolvimento podem ser monitorados in vivo. Essas características tornam o zebrafish um organismo modelo perfeito para controlar a atividade de uma variedade de agentes químicos e proteínas pela luz concentrada. Aqui nós descrevemos o uso de microscopia de dois fótons de induzir a ativação de fluoresceína quimicamente enjaulado, que por sua vez, permite-nos a seguir o destino de células em embriões vivos zebrafish. Nós usamos embriões expressando um marco vivo genética (GFP) para localizar e precisamente alvo as células de interesse. Este procedimento pode ser igualmente utilizado para a ativação induzida luz precisa de proteínas, hormônios, pequenas moléculas e outros compostos enjaulado.

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Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Microscopia multifotônica permite o controle de fótons de baixa energia com penetração profunda e fototoxicidade óptica reduzida. Descrevemos a utilização desta tecnologia para a rotulagem de células vivas em embriões de peixe-zebra. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para foto-indução de várias moléculas sensíveis à luz.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Glicanos imagem em embriões Zebrafish por Labeling Metabólica e Química Clique Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...