Name: using an automated cell counter to simplify gene expression studies: sirna knockdown of il-4 dependent gene expression in namalwa cells
Uploaded: 2010-04-14T14:30:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells at JoVE.com

1. Het voorbereiden en het tellen van de cellen Namalwa <ol><li> Verwijder de cellen van cultuur kolf en centrifuge de cellen pellet. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in een bekend volume van de PBS. De cellen die worden gebruikt in dit protocol zijn suspensie-cellen. Als u gebruik maakt van hechtende cellen je nodig hebt om trypsinize voor het verzamelen. </li><li> Voor het bepalen van het aantal levende cellen, vlek een aliquot van de celsuspensie door het te mengen 1:1 met een 0,4% trypan blauwe oplossing en pipet 10 pi van het mengsel op een glijbaan te tellen, en plaats de dia in de TC 10 automatisch cel teller (Bio-Rad Laboratories, Inc). </li><li> De TC 10 celgetalmeter zal autofocus om de meest nauwkeurige telling te verzekeren, en ga verder met het tellen. Het bepaalt automatisch de dichtheid van levende cellen en totale cellen in het monster. </li><li> Selecteer de afbeelding om te bekijken van de cellen op het viewscreen display. Selecteer vervolgens de verdunning rekenmachine om de TC 10 celgetalmeter hebben automatisch berekent het bedrag van cel mengsel dat nodig zal zijn. </li><li> Dit experiment is met behulp van een totaal van drie siRNA&#39;s: een controle siRNA en twee verschillende siRNA&#39;s gericht op de STAT6 gen, plus ongetransfecteerde controles. Dit vereist 3,6 ml bij een uiteindelijke concentratie van 5 X 10 6 cellen per ml. </li><li> Voer de gewenste concentratie en laatste deel waarden in de verdunning rekenmachine, en het berekent het volume van de celsuspensie die nodig zijn op basis van de levende cellen tellen voor dat monster. U kunt ook handmatig de berekening. Vervolgens overbrengen van het vereiste volume van de cel mengsel voor deze experimenten in een nieuwe buis. </li><li> Spin de cel mengsels pellet de cellen en verwijder alle PBS. Resuspendeer in 3,6 ml van Gene Puiser elektroporatie buffer (Bio-Rad Laboratories). Transfer 800 ul monsters in buizen met daarin de juiste siRNA&#39;s en meng voorzichtig. De cellen zijn nu klaar voor elektroporatie. </li></ol> 2. Electroporating de cellen in 96-well platen <ol><li> De 96-well plaat elektroporatie kan de duplo&#39;s voor alle vier de behandelingen om samen te zijn geëlektroporeerd. </li><li> Overdracht 150 pi van de celsuspensie in de juiste wells van een 96-wells plaat elektroporatie. </li><li> Plaats de plaat in de MXcell elektroporatie plaat kamer en sluit het deksel. </li><li> Electroporate met de instellingen geoptimaliseerd voor de cellijn en de buffer wordt gebruikt. Deze cellen zijn geëlektroporeerd met behulp van een exponentiële verval golf met een instrument instellingen van 250 V, 350 uF, en 1000 Ω weerstand. </li><li> Na de elektroporatie is voltooid, pipet op en neer voorzichtig in elk putje om vervolgens mengen en cellen over te dragen aan een weefselkweek plaat met voorverwarmde media. Namalwa cellen worden gekweekt in RPMI (Life Technologies), aangevuld met 7,5% FCS en 1% pyruvaat. </li><li> Controlemonsters die niet zijn geëlektroporeerd worden genomen van de resterende celsuspensie en toegevoegd aan de cultuur gerechten van voorverwarmde kweekmedium identiek aan de geëlectroporeerd cellen. </li><li> Incubeer cellen een nacht bij 37 ° C met 5% CO 2. </li><li> Na 24 uur werd een verzameling cellen geïnduceerd met 10 ng / ml uiteindelijke concentratie recombinant IL-4 (R &amp; D Systems). De tweede set van controle cellen alleen aanvullende media. Alle cellen worden geïncubeerd een extra 24 uur bij 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol> 3. Extract en controleer RNA <ol><li> Na een totaal van 48 uur van de groei, de telling van de cellen in elk putje, en de overdracht een aliquot van elk putje naar een microfugebuis voor RNA-extractie en het bevriezen van een tweede volume voor de western blotting of andere eiwit analyse. </li><li> Centrifuge monsters naar pellet de cellen, en vervolgens te verwijderen en het supernatant gooi van elk buisje. </li><li> Ga verder met de RNA-extractie. Wij gebruiken meestal de Aurum totaal RNA kit (Bio-Rad) volgens de meegeleverde protocol. </li><li> Bij het bewaken van siRNA gemedieerde gen knock-down is het vooral belangrijk om te controleren of RNA-kwaliteit, omdat gedegradeerd RNA geeft misleidende resultaten. De 260/280 verhouding geeft niet aan RNA integriteit daarom is het belangrijk om de monsters lopen op een gel of microfluïdische apparaat om te controleren RNA worden niet afgebroken. </li><li> Voor de beoordeling van zowel de kwaliteit en kwantiteit in een stap, zullen deze monsters worden geanalyseerd met behulp van de Experion automatische elektroforese-systeem (Bio-Rad). </li><li> De eerste, warmte monsters. Vervolgens, prime, laden en vortex de Experion RNA-chip. Plaats de chip in de Experion elektroforese station en begin met lopen. </li><li> Na de run is voltooid, wordt de software automatisch Experion resultaten weergeven in de vorm van een electropherogram, resultaten tafel (dat wordt weergegeven RNA-concentratie, ribosomale ratio, en de RNA-kwaliteit indicator nummer), en virtuele gel (die lijkt op een traditionele RNA gel). Hoge kwaliteit totaal RNA monsters hebben typisch een RQI van 8-10. </li&gt; </ol> 4. Real-time PCR <ol><li> Na verificatie van de RNA-kwaliteit, verder met de cDNA reacties. Dit experiment gebruikte de iScript een-stap RT-PCR-mix (Bio-Rad) om cDNA synthese en real-time PCR combineren in een reactie. </li><li> Maak een meester mix met alle reacties op andere onderdelen dan de RNA-sjablonen voor elke primer in te stellen en te verspreiden die in de PCR-plaat. </li><li> Na verdunning van het RNA om een ​​uniforme concentratie, voeg de RNA monsters naar de juiste bronnen. Elke reactie wordt opgezet in drievoud. </li><li> Seal de plaat, en plaats deze in de CFX384 real-time PCR-systeem (Bio-Rad). Selecteer het juiste protocol en beginnen met het lopen. </li><li> Zodra de run is voltooid, wordt genexpressie bepaald door het vergelijken van gen-expressie van het gen van belang genormaliseerd naar een referentie-gen in cellen geëlektroporeerd met experimentele siRNA om dezelfde normalisering van de cellen geëlektroporeerd met een controle siRNA. </li></ol> 5. Analyse van de siRNA knock-down <ol><li> De expressie van CCL17 werd gecontroleerd met behulp van kwantitatieve real-time PCR om de rol van de transcriptionele activator STAT6 onderzoeken in IL-4 afhankelijke inductie van CCL17. Voor dit experiment werd GAPDH gebruikt als een referentie-gen. Alternatieve referentie-genen of meerdere referentie-genen kunnen worden gebruikt op dezelfde manier. </li><li> De CFX Manager-software automatisch genormaliseerd CCL17 expressie om expressie van het referentie-gen van hetzelfde monster en automatisch vergeleken de resulterende genormaliseerde waarden op behandelingen bedienen door eenvoudig te selecteren GAPDH als &quot;referentie&quot; en de controle behandeling (controle siRNA zonder IL-4 inductie) als &quot;controle&quot; in het experiment instellingen venster van de CFX manager software. </li><li> Zonder IL-4 inductie, transcriptie van CCL17 bleef op een laag, constitutieve niveaus die vergelijkbaar zijn met de controle-behandeling. </li><li> Cellen geïnduceerd met IL-4 en behouden van een normale STAT6 pad (dat wil zeggen, controle siRNA of ongetransfecteerde controle behandelingen) toonde 8-10 maal inductie van CCL17 expressie. </li><li> Cellen geïnduceerd met IL-4, maar met STAT6 uitdrukking geremd door de introductie van een van beide STAT6 siRNA bleek slechts ongeveer twee maal hoger CCL17 expressie dan de niet-geïnduceerde cellen bevestiging van de rol van STAT6 in de IL-4 geïnduceerde expressie van CCL17. </li></ol> 6. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Overzicht van de IL-4 signaalweg. A) Binding van IL-4 aan de receptor leidt tot dimerisatie en activering van STAT6. Geactiveerd STAT6 naar de kern en activeert transcriptie van zijn doel genen, zoals CC17. B) zonder IL-4 inductie, zal de transcriptie van CCL17 blijven op een laag, constitutief niveaus. C) Na siRNA-gemedieerde zwijgen van de STAT6 gen, moet de behandeling met IL4 leiden tot weinig of geen toename van CCL17 expressie. <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Inductie van CCL17 door IL4 gemeten door verschillende omstandigheden met behulp van kwantitatieve real-time PCR. A) monsters geteeld zonder IL-4 had een lage constitutieve niveau van expressie, ongeacht van genexpressie. B) Zoals in groen en blauw, controlemonsters reageerde normaal op de behandeling met IL-4, met een 8-10 maal inductie van CCL17. Echter, cellen getransfecteerd met siRNA gericht op STAT6, weergegeven in rood en roze, had verminderd CCL17 expressie in reactie op IL-4, het ondersteunen van het idee dat STAT6 speelt een rol in de IL-4 geïnduceerde expressie van CCL17.

De auteur is werkzaam bij Bio-Rad Laboratories, dat reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

Dit artikel heeft aangetoond hoe siRNA electroporate in een moeilijk tot opschorting cellijn transfecteren en hoe genexpressie te volgen in deze cellen. Bij het doen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de dingen zo consistent mogelijk in alle monsters te houden.

using an automated cell counter to simplify gene expression studies: sirna knockdown of il-4 dependent gene expression in namalwa cells

Het gebruik van siRNA gemedieerde gen knockdown blijft een belangrijk instrument in studies van genexpressie worden. siRNA studies worden uitgevoerd, niet alleen om de effecten van downregulating enkele genen te bestuderen, maar ook om signaalwegen en andere complexe interactie netwerken ondervragen. Deze pad analyses vereisen zowel het gebruik van relevante cellulaire modellen en methoden die minder storing van de cellulaire fysiologie kunnen veroorzaken. Elektroporatie wordt in toenemende mate gebruikt als een effectieve manier om siRNA en andere nucleïnezuren te introduceren in moeilijk te cellijnen en primaire cellen transfecteren zonder dat de signaleringsroute in onderzoek. Er zijn meerdere kritische stappen naar een succesvolle siRNA experiment, en er zijn manieren om het werk te vereenvoudigen, terwijl het verbeteren van de kwaliteit van gegevens op verschillende experimentele fase. Om u op weg helpen met uw siRNA gemedieerde gen knockdown project, zullen we laten zien hoe je een pad studie te voltooien van het verzamelen en tellen van de cellen voorafgaand aan de elektroporatie door na transfectie real-time PCR-genexpressie analyse uit te voeren. De volgende studie onderzoekt de rol van de transcriptionele activator STAT6 in IL-4 afhankelijke genexpressie van CCL17 in een Burkitt lymfoom cellijn (Namalwa). Aangetoond dat de technieken zijn nuttig voor een brede waaier van siRNA-gebaseerde experimenten op zowel hechtende en ophanging cellen. We zullen ook zien hoe de cel tellen met de TC 10 geautomatiseerde cel tegen te gaan, hoe u meerdere monsters tegelijk met het MXcell elektroporatie systeem electroporate, en hoe tegelijkertijd te beoordelen RNA kwaliteit en kwantiteit van de Experion geautomatiseerde elektroforese te vereenvoudigen.

Watch this Scientific Journal Video about Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells at JoVE.com

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Deze procedure beschrijft een snelle en eenvoudige workflow om siRNA te introduceren in moeilijk om cellijnen te transfecteren en gen-expressie te volgen door real-time PCR. Het gebruik van een geautomatiseerd celgetalmeter, multi-well plaat elektroporatie, en geautomatiseerde elektroforese station zorgen voor een snelle en betrouwbare resultaten, zonder de noodzaak voor dure robot handling.

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero en ex vivo Elektroporatie voor Gene Expression Mouse in retinale ganglioncellen

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Spinal Cord Electrophysiology

Spinal Cord Elektrofysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffine ingebedde en vriescoupes van Drosophila Adult Spieren

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Voorbereiding van Cell-lijnen voor Conditional Knockdown van genexpressie en meting van de Knockdown Effecten op E4orf4-geïnduceerde celdood

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...