Name: deficient pms2, ercc1, ku86, ccoi in field defects during progression to colon cancer
Uploaded: 2010-07-28T17:00:00
Duration: 28 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer at JoVE.com

Le financement fourni par le sud de l&#39;Arizona Anciens Combattants de la santé Système de soins de VA examen du mérite 0142 de subvention et l&#39;Arizona recherche biomédicale subvention de la Commission 0803.

Préparation des tissus pour être visualisé sur diapositives <ol><li> Un coloscope peut être passé dans le côlon par l&#39;anus. Un coloscope est un long tube qui a un éclairage et une caméra vidéo à la tête, la capacité de passer de l&#39;air dans le côlon de le faire sauter comme un ballon long pour permettre une meilleure visualisation du côlon, et a un passage pour les pinces à biopsie qui peut s&#39;étendre au-delà de la caméra vidéo pour pincer une zone 3-5 millimètre de la surface &quot;peau&quot; intérieure ou couche muqueuse du côlon pour nous donner un échantillon de biopsie. Les pinces à biopsie peut aussi être utilisé pour enlever éventuellement polypes précancéreux dans le côlon. </li><li> Nous avons obtenu des biopsies de tissus muqueux colique normale chez les patients, avec le consentement éclairé. Ces patients ont été l&#39;objet d&#39;une coloscopie de dépistage dans une clinique de gastro-intestinal. Notre biopsies ont été placés dans des bocaux de formol. Après 4 heures, le formol a été remplacé par l&#39;alcool à 70%. </li><li> Échantillons de tissus similaires ont été prises à partir des zones de résections du côlon, enlevée pendant la chirurgie, qui étaient de 1 cm et 10 cm de cancers du côlon ou adénomes avec néoplasie avancée. Ces échantillons de tissus ont également été placés dans du formol, et si les échantillons de tissus ont été grands, certains ont été conservés dans le formol pour une longue période avant d&#39;être placé dans l&#39;alcool à 70%. </li><li> Les échantillons de tissu sont pris à un laboratoire d&#39;histologie pour être traités et placés dans des blocs de paraffine. </li><li> Les blocs de paraffine sont refroidis dans un réfrigérateur pour les rendre plus facilement coupé par un microtome. </li><li> Des sections de tissu de 4 microns d&#39;épaisseur sont découpées dans les blocs de tissus, en utilisant un microtome, et flottait sur l&#39;eau. </li><li> Pour comparer l&#39;expression des deux protéines, par exemple ERCC1 et PMS2, des coupes de tissus de remplacement peuvent être ramassés sur deux diapositives, jusqu&#39;à il ya trois sections de tissus sur chacun des deux lames. Par exemple, les articles 1, 3 et 5 peut être placé sur une lame étiquetés ERCC1 et les articles 2, 4 et 6 peuvent être placés sur une diapositive étiquetés PMS2. Avoir trois sections de tissus immunocolorées pour une protéine sur une seule lame peut vous permettre de voir si une tendance inhabituelle coloration d&#39;une crypte est un artefact ou est réel, puisque les artefacts ne seraient pas répétées dans plus d&#39;une coupe de tissu sur une lame. Cryptes du côlon sont d&#39;environ 60 microns de diamètre, alors que près de 15 sections de tissus pourraient être réduits grâce à une crypte, et la crypte même chose pourrait être visualisées sur des coupes de tissus multiples par diapositive. </li></ol> Immunocoloration coupes de tissus <ol><li> Les lames sont ensuite soumises à la procédure marquage immunohistochimique. Ceci est une procédure de huit heures, et est assez standard. Les pièces de la procédure que nous utilisons, qui ne sont pas standard, sont l&#39;utilisation de conteneurs Sequenza pour la coloration, et l&#39;utilisation d&#39;une solution pour réduire la coloration de fond appelée &quot;Sniper&quot;. Le &quot;sniper&quot; solution est vendu comme une formule exclusive par Biocare médicale, Concord en Californie. </li><li> Certaines des étapes de nos procédures sont présentées ici. </li><li> À titre d&#39;exemple, pour PMS2 immunohistochimie, diapositives sont d&#39;abord déparaffinées en plaçant en 3 changements de xylène (3 minutes chacun), suivis par deux changements dans l&#39;éthanol à 100% (2 minutes chacun), suivis par deux changements dans l&#39;éthanol à 95% (2 minutes chacun), suivis par les deux changements d&#39;eau distillée (2 minutes chacun). Ces procédures sont réalisées sous une hotte chimique avec la pression d&#39;air négative de sorte que l&#39;expérimentateur n&#39;est pas exposé à des vapeurs. </li><li> Lorsque le formol a été initialement utilisée pour fixer le tissu, les pièces des protéines dans l&#39;échantillon de tissu est devenu réticulé. Maintenant nous avons besoin de rompre les liens inter-sorte qu&#39;un anticorps capable de reconnaître la protéine d&#39;intérêt. Les lames sont placées dans une solution tampon qui est amenée à ébullition dans un four à micro-ondes. Il est suivi par 10 minutes sur le réglage moyen, suivi d&#39;un refroidissement pendant 20 minutes sur la glace. Cette étape doit être testé et ajusté pour les micro-ondes différentes, jusqu&#39;à ce que de bons résultats sont obtenus. Notez que pour l&#39;immunocoloration CCOI ou Ku86 nous avons utilisé un tampon citrate de sodium fait avec l&#39;acide citrique + 9 ml de citrate de sodium 41mL + 450mL H 2 O (un tampon, y compris les ions sodium), qui avait un pH d&#39;environ 6,0 pour ERCC1, nous avons utilisé un tampon citrate fait à l&#39;acide citrique 2,1 g + 1 litre H 2 O + ~ hydroxyde de sodium 5 ml d&#39;apporter pH à 6.1 (un tampon avec un minimum d&#39;ions sodium ajouté), et pour PMS2 nous avons utilisé une solution faite avec une solution Antigène Démasquer 5mL (par le vecteur) + 533mL H 2 O. Différents tampons sont nécessaires pour accroître l&#39;interaction des anticorps avec des épitopes des protéines particulières. </li><li> Les lames sont ensuite mis en peroxyde d&#39;hydrogène à 3% (dilué dans du méthanol) pendant 20 minutes suivie d&#39;un rinçage à l&#39;eau distillée pendant 3 minutes, et lavés dans un tampon phosphate salin (PBS appelé) pendant 5 minutes. </li><li> Les lames sont ensuite placés dans l&#39;appartement de racks coloration étroit appelé Sequenza (Système Shandon Immunocoloration Sequenza de Thermo Scientific) et rincées avec du PBS. </li><li> Les diapositives étant immunocolorées pour ERCC1 ou PMS2 sont ensuite exposés à 10 minutes d&#39;exposition à un traitement supplémentaire de 3 gouttes d&#39;une solution propriétaire, obtenu à partir Biocare, appelé «Sniper», qui agit pour réduire la non-coloration des protéines spécifiques de fond. </li><li> Les lames sont rincées avec un tampon &quot;TBST&quot; qui est de 1 ml + 100 ml de Tween 10x Tris + 900 ml d&#39;eau distillée [où 10x Tris est de 24,2 grammes Trizma + 80 grammes de NaCl + 1000 ml d&#39;eau distillée et déminéralisée + HCl concentré (environ 15 ml) d&#39;apporter la solution à pH 7,6]. </li><li> Les lames sont ensuite rincés trois fois avec un tampon, et 100 microlitres d&#39;anticorps secondaire biotinylé DAKO au 1:100 dilution (en 2% d&#39;albumine sérique bovine constitué dans le tampon TBST) est ajoutée à la glisse et incubé pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> À ce stade, Vectastain ABC (avidine biotine) (à partir de Vector Laboratories) réactif est préparé, en utilisant 2,5 ml de PBS, une solution de laisser tomber une, une solution B de chute, et la solution est laissée au repos pendant 30 minutes. </li><li> Les lames sont rincées 3 fois avec le tampon TBST. </li><li> Puis 3 gouttes de réactif Vectastain ABC est ajouté et les lames sont incubées à température ambiante pendant 30 minutes, suivi d&#39;un rinçage 2 fois avec TBST. </li><li> Les lames sont ensuite immergées dans le DAB (diamino-benzamide) (2,9 ml DAB + 400 microlitres de PBS + 250 microlitres du peroxyde d&#39;hydrogène) pendant environ 5 minutes. </li><li> Les lames sont ensuite rincés 2 fois à l&#39;eau distillée, eau déminéralisée. </li><li> Contre-coloration est faite avec une solution diluée d&#39;hématoxyline pendant 10 secondes. Les lames sont soigneusement rincés à l&#39;eau du robinet, suivi d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Les lames sont ensuite déshydratées 2 fois pendant 2 minutes dans de l&#39;éthanol à 95%, 2 fois pendant 2 minutes dans de l&#39;éthanol 100% et 2 fois pendant 2 minutes dans le xylène. </li><li> Un couple de gouttes de Cytoseal XYL (Richard-Allan scientifique) sont ensuite ajoutés à la glisse et une lamelle appliquée. </li><li> L&#39;évaluation immunohistochimique de ERCC1, Ku86 et CCOI sont effectuées en utilisant le même protocole que pour les PMS2, mais en remplaçant l&#39;anticorps PMS2 avec des anticorps pour ERCC1, Ku86 et CCOI décrites dans le tableau ci-dessous. </li></ol> Évaluation des coupes de tissus pour les cryptes déficient dans l&#39;expression de ERCC1, PMS2, Ku86 et CCOI <ol><li> Nous examinerons d&#39;abord des coupes de tissus sous un Motic (DM-BA300) photomicroscope pour l&#39;expression de ERCC1 et PMS2 dans les cryptes de la muqueuse colique. </li><li> PMS2 et ERCC1 sont deux enzymes de réparation de l&#39;ADN, et donc ils sont situés là où l&#39;ADN est, dans les noyaux des cellules des cryptes. Ceci est indiqué dans la figure 1, où le colon brune représentant de coloration pour ERCC1, se produit dans les noyaux des cellules dans une crypte. La crypte normale, nous montrons d&#39;abord dans le microscope a été colorées pour ERCC1, et la tache brune montre l&#39;emplacement de ERCC1. Nous rappelons les types de cellules dans les cryptes, où &quot;cellules caliciformes&quot; sont en forme un peu comme un verre de vin, avec des noyaux à une petite région à la base des cellules sur le bord extérieur de la crypte, et un ballonnement article, rempli de granules de mucine blanc dans la partie de la cellule à l&#39;intérieur de la crypte. Les deux autres types de cellules regard un peu comme dans nos sections colorées, et ils sont les entérocytes et cellules entéroendocrines, et leurs noyaux sont également au bord extérieur de la crypte, à la base des cellules. Dans les biopsies prélevées chez des patients qui n&#39;ont jamais eu une néoplasie du côlon, ou dans des biopsies loin de tout site de cancer du côlon, la quasi-totalité des noyaux dans tous les cryptes normales montrent haut niveau d&#39;expression de ERCC1 comme indiqué ici. </li><li> Pour orienter nos observations, des coupes de tissus obtenus à partir de biopsies de patients atteints de néoplasie du côlon ne sont observés pour des niveaux d&#39;expression de PMS2, ERCC1, CCOI ou Ku86 dans la muqueuse colique normale. Nous pouvons observer tous les cryptes dans une section de tissu normal, avec un objectif 40x, comme nous avons lentement passer par une section de tissu ensemble et souligner les cryptes, les cellules interstitielles, toute nodules lymphoïdes sur la lame, et la musculeuse (si présent dans la biopsie). </li><li> Nous rappelons également qu&#39;il ya juste plusieurs cellules à la base de la crypte qui sont les cellules souches. Ces cellules souches générer tous les environ 2.000 cellules de la crypte complète. Une cellule souche présentant une mutation ou d&#39;une epimutation peut prendre en charge la niche de cellules souches entier. Puis la crypte l&#39;ensemble peut avoir modifié coloration pour une enzyme d&#39;intérêt (conversion crypte) comme nous le montrons dans cette nouvelle diapositive, où nous voyons les cryptes toute déficientes pour CCOI côté de cryptes qui ont une expression élevée de CCOI. </li><li> Ensuite, nous montrons une diapositive à partir d&#39;un patient avec un cancer du côlon ou un adénome avec néoplasie avancée. Sur cette diapositive, certains ont des cryptes normales haut niveau d&#39;expression de ERCC1 et certains ont des niveaux inférieurs de l&#39;expression. Tous les cryptes dans la section des tissus sont photographiés à basse résolution avec un objectif 10x, et les images sont carrelées de sorte que la section de tissu entier est vu dans une seule image. Les cryptes sont ensuite numérotées. </li><li> Les cryptes avec une expression élevée de l&#39;enzyme, typique des cryptes dans les biopsies de loin BOFm toute forme de cancer, sont appelés au niveau «4» coloration. Les autres niveaux sont «0» s&#39;il n&#39;ya pas d&#39;expression détectable, &quot;1&quot; si l&#39;expression à peine détectable est évident, &quot;2&quot; s&#39;il n&#39;y est présent l&#39;expression, mais à un niveau beaucoup plus bas que le niveau 4, et &quot;3&quot; si l&#39;expression est présent à un niveau inférieur à 4, mais assez forte. Nous points chaque diapositive sur le bleu d&#39;image à faible résolution pour 4, vert pour 3, jaune pour 2, orange pour une et rouge pour 0. Ici, nous montrons en passant par une section d&#39;une biopsie à l&#39;aide d&#39;un objectif 40x. Nous parsèment les cryptes de l&#39;image à faible résolution. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Une crypte colique montrant une expression élevée de ERCC1 dans les noyaux des cellules des cryptes. Toutes les couleurs de cette image ont été aussi renforcée dans le contraste et la saturation, à l&#39;aide de Paint Shop Pro 5. Les résultats représentatifs <ol><li> Les sections de tissus de remplacement sur des lames séparées nous permettre de regarder les cryptes coliques mêmes, avec une expression de deux protéines différentes montré par immunohistochimie. L&#39;image de l&#39;un coloré crypte pour PMS2 et le teint même crypte pour ERCC1 est indiqué sur les microscopes adjacente avec des écrans d&#39;ordinateur adjacentes. Cela nous permet de déterminer s&#39;il ya carence conjointe de deux protéines ou si les déficiences dans chacune des protéines, alors que chacun est fréquente, se produit de façon indépendante. Nous avons trois sections de tissu par lame, de sorte que toute lacune apparente dans l&#39;expression d&#39;une protéine peut être vérifiée comme étant déficient à plus d&#39;une section, et non due à un artefact. Dans les tissus environnants cancers du côlon, où il ya une anomalie du champ donnant lieu à un cancer, il ya une fréquence élevée des cryptes déficientes pour ERCC1 et PMS2. </li><li> Nous avons également utilisé l&#39;immunohistochimie pour trouver la fréquence des cryptes déficientes pour Ku86 et CCOI. Sur cette diapositive, nous passons par une section de tissu ensemble immunocolorées pour Ku86, en utilisant un objectif 40x, et nous pouvons voir que quelques cryptes sont déficientes pour Ku86 dans cette section des tissus. </li><li> De même, sur cette diapositive, nous passons par une section de tissu ensemble immunocolorées pour CCOI, en utilisant un objectif 40x, et nous pouvons voir que seul un nombre modéré de cryptes sont déficientes pour CCOI. </li></ol>

<ol>
	<li>Slaughter, D. P., Southwick, H. W., Smejkal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+cancerization+in+oral+stratified+squamous+epithelium;+clinical+implications+of+multicentric+origin.">Field cancerization in oral stratified squamous epithelium; clinical implications of multicentric origin.</a> Cancer. 6, 963-968 (1953).</li><li>Vauthey, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+field+cancerisation+in+clinical+oncology.">Importance of field cancerisation in clinical oncology.</a> Lancet Oncol. 1, 15-16 (2000).</li><li>Bernstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+defects+in+progression+to+gastrointestinal+tract+cancers.">Field defects in progression to gastrointestinal tract cancers.</a> Cancer Lett. 260, 1-10 (2008).</li><li>Calabrese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+pretumor+progression+before+and+after+loss+of+DNA+mismatch+repair.">Colorectal pretumor progression before and after loss of DNA mismatch repair.</a> Am J Pathol. 164, 1447-1453 (2004).</li><li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Pms2+expression+in+non-neoplastic+flat+mucosa+from+patients+with+colon+cancer+correlates+with+reduced+apoptosis+competence.">Reduced Pms2 expression in non-neoplastic flat mucosa from patients with colon cancer correlates with reduced apoptosis competence.</a> Appl Immunohistochem Mol Morphol. 14, 166-172 (2006).</li><li>Huang, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+marker+for+normal+and+malignant+human+colonic+stem+cells+(SC)+and+tracks+SC+overpopulation+during+colon+tumorigenesis.">Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells (SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis.</a> Cancer Res. 69, 3382-3389 (2009).</li><li>Kim, K. M., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+reveals+a+niche:+stem+cell+succession+in+human+colon+crypts.">Methylation reveals a niche: stem cell succession in human colon crypts.</a> Oncogene. 21, 5441-5449 (2002).</li><li>Greaves, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+are+established+in+human+colonic+stem+cells,+and+mutated+clones+expand+by+crypt+fission.">Mitochondrial DNA mutations are established in human colonic stem cells, and mutated clones expand by crypt fission.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 714-719 (2006).</li><li>Nara, K., Nagashima, F., Yasui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+elevated+ultraviolet-induced+mutation+frequency+in+isolated+Chinese+hamster+cell+lines+defective+in+nucleotide+excision+repair+and+mismatch+repair+proteins.">Highly elevated ultraviolet-induced mutation frequency in isolated Chinese hamster cell lines defective in nucleotide excision repair and mismatch repair proteins.</a> Cancer Res. 61, 50-52 (2001).</li><li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxycholate+induces+mitochondrial+oxidative+stress+and+activates+NF-kB+through+multiple+mechanisms+in+HCT-116+colon+epithelial+cells.">Deoxycholate induces mitochondrial oxidative stress and activates NF-kB through multiple mechanisms in HCT-116 colon epithelial cells.</a> Carcinogenesis. 28, 215-222 (2007).</li><li>Lim, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+induced+by+reactive+oxygen+species+in+hepatocellular+carcinoma:+methylation+of+the+E-cadherin+promoter.">Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter.</a> Gastroenterology. 135, 2128-2140 (2008).</li><li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+as+carcinogens+in+human+gastrointestinal+cancers.">Bile acids as carcinogens in human gastrointestinal cancers.</a> Mutat Res. 589, 47-65 (2005).</li><li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hydrophobic+bile+acids,+genomic+instability,+Darwinian+selection,+and+colon+carcinogenesis.">hydrophobic bile acids, genomic instability, Darwinian selection, and colon carcinogenesis.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 1, 19-47 (2008).</li></ol>

<ol><li> Il est très important d&#39;avoir trois sections de tissu par lame. Bulles peuvent survenir lors de l&#39;application des médias portant l&#39;anticorps, de sorte que certains des cryptes ou des portions de cryptes ne peut pas être colorées de manière adéquate juste parce qu&#39;une bulle empêché l&#39;anticorps réagissant avec la coupe de tissu. Cryptes sont d&#39;environ 60 microns de diamètre, et des coupes de tissus sont 4 microns d&#39;épaisseur, donc il pourrait y avoir jusqu&#39;à 15 coupes de tissus à travers la même crypte. Il est généralement possible de trouver la même crypte, en utilisant la morphologie de la crypte comme un guide, sur coupes de tissus multiples placé sur une lame. </li><li> Dans nos études récentes, des échantillons de tissu de grandes, de coloration dans une Sequenza ne peut pas donner une couverture bon anticorps au tissu. Dans ces cas, on peut préférer utiliser la main coloration du tissu, où une baisse des supports contenant l&#39;anticorps est la main placée au-dessus de chaque échantillon de tissu. </li><li> Pour voir clairement la coloration brune montrant l&#39;expression de la protéine immunocolorés, et la coloration au bleu montrant l&#39;ADN nucléaire sur l&#39;écran de l&#39;ordinateur, le logiciel photomicroscope Motic est ajusté comme suit: Gain 0, offset 0, Améliorer 0, 255, Gamma 1,00, 0, Netteté 1, 7 Correction des couleurs R, G, B Gain 1,00 et R, G, B Luminosité 0. La résolution est fixé à 1024 x 768, et la balance des blancs est activé. </li><li> Notre méthode pourrait être utilisée avec toutes les protéines jugées importantes dans la progression d&#39;un cancer du côlon, d&#39;évaluer leur fréquence de la carence, voire la surexpression, dans les anomalies du champ entourant les cancers du côlon ou adénomes avec néoplasie avancée. </li><li> Des anomalies du champ sont une partie de la progression vers le cancer Le &quot;cancérisation champ&quot; terme a été utilisé par Slaughter et al. En 1953 pour décrire une une zone ou un «champ» de l&#39;épithélium qui a été préconditionnés par des processus largement inconnus (à l&#39;époque) afin de le prédisposer au développement d&#39;un cancer. L&#39;utilisation initiale était dans le contexte des cancers buccaux. Depuis lors, le «champ de cancérisation» et «une anomalie du champ» ont été utilisés plus largement pour décrire n&#39;importe quel tissu pré-malignes dans lequel de nouveaux cancers sont plus susceptibles de survenir, et le concept de champ de cancérisation en oncologie clinique a reçu une attention croissante 2 . Nous avons récemment passé en revue les preuves pour des anomalies du champ dans le cancer gastro-intestinal 3. Sont inclus dans cette étude ont été les résultats d&#39;une douzaine d&#39;études fournissant des preuves des anomalies du champ dans le côlon. Des anomalies du champ dans la muqueuse colique proviennent probablement par la sélection naturelle des cellules mutantes ou des cellules épigénétiquement altéré parmi les cellules souches d&#39;une crypte telle que l&#39;on survit à 4 cellules souches relève de niche. L&#39;instabilité génétique ou d&#39;un phénotype mutateur, peut-être due à la réduction de la réparation par excision de nucléotides ADN ou ADN de réparation des mésappariements, permettrait d&#39;accélérer ce processus (et un défaut fréquent dans PMS2 a été précédemment rapporté dans les zones entourant les cancers du côlon 5). Si, dans une population normale de cellules souches dans la muqueuse colique, une cellule acquiert un avantage sélectif par le biais d&#39;une mutation ou d&#39;une epimutation, il aura tendance à élargir clonale au détriment des cellules souches voisines. Dans la muqueuse du côlon, la niche de cellules souches est occupé par ≤ 5 6 cellules qui donnent ensuite naissance à tous (environ 2000), les cellules de la crypte. Une reprise de la niche de cellules souches par un mutant ou des résultats épigénétiquement modifié le type de cellules dans la &quot;conversion crypte&quot; 7. La propagation de clones mutés (cryptes converties) dans l&#39;épithélium du côlon peuvent surviennent le plus souvent par la fission crypte 8. Un exemple de la fission crypte est montré dans la figure 2. De cette façon, un patch de tissu anormal survient. Dans un tel patch, une seconde mutation peut se produire de telles sorte que la crypte donnée acquiert un avantage par rapport à d&#39;autres cryptes au sein du patch, et cette crypte élargira clonale formant un patch secondaires dans le patch d&#39;origine. Dans ce nouveau patch, le processus peut être répété plusieurs fois plus, peut-être au fil des décennies, jusqu&#39;à ce qu&#39;une cellule souche maligne qui se développe par clonage pose un cancer. Si cela est le processus général par lequel sporadiques adénocarcinomes coliques surviennent, puis d&#39;adénocarcinomes du côlon général devrait être associé à, et être précédé d&#39;, les champs de l&#39;anormalité. Ainsi, un correctif de cryptes converties pourrait s&#39;attendre à avoir des défauts décelables dans les alentours d&#39;un adénome avec néoplasie avancée, ou autour d&#39;un cancer du côlon. A partir de ce modèle de pré-progression tumorale, on pourrait s&#39;attendre à trouver des altérations génétiques ou épigénétiques liées à la pré-tumorales progression parmi les échantillons de tissus provenant de la muqueuse du côlon non néoplasiques dans les zones entourant les lésions néoplasiques du côlon qui sont susceptibles d&#39;évoluer vers un cancer . En particulier, les défauts dans les enzymes de réparation d&#39;ADN ou de protéines nécessaires à l&#39;apoptose, pourrait contribuer à la progression en augmentant l&#39;instabilité génomique, et on pourrait s&#39;attendre à trouver dans un champ défectueux. </li><li> Sélection de carence en PMS2 lorsque les cellules sont deficient pour ERCC1 et soumis à un agent endommageant l&#39;ADN Nara et coll. 9 ont augmenté de 25 cultures de cellules ovariennes de hamster chinois 43-3B, le tout avec une mutation inactivant le gène ERCC1 réparation de l&#39;ADN, et les cultures traitées avec un agent endommageant l&#39;ADN, MNNG. Parmi les cellules survivantes dans le traitement des dommages de l&#39;ADN, une seule cellule a été isolée de chaque culture et a permis de former un clone. Tous les clones isolés ont été environ 10 fois plus résistant à la tuer par MNNG que la souche parentale. Parmi les clones isolés, 22 ont été se sera avéré défectueux dans la réparation de mésappariements de l&#39;ADN (MMR). Cinq de ces 22 clones ont été testés par séquençage, et trois des cinq étaient déficientes pour PMS2. Cette sélection pour défaut de PMS2 était vraisemblablement parce PMS2 carences causées résistance à l&#39;apoptose, et donc la capacité de survivre à l&#39;endommagement de l&#39;ADN dans les cellules restantes ajouté lors ERCC1 était absent. (Normalement, PMS2 niveaux sens dommages à l&#39;ADN, les cellules et les causes de subir l&#39;apoptose lors dommages à l&#39;ADN est excessive.) Ainsi, une carence en PMS2 est sélectionné pour quand ERCC1 cellules déficientes sont soumis à des dommages à l&#39;ADN. Clones défectueuse dans les deux ERCC1 et PMS2 ont démontré qu&#39;ils ont un taux d&#39;environ 500 à 1000 fois plus grande mutation lorsqu&#39;il est irradié par UV que les cellules parentales. </li><li> Les acides biliaires provoquent un stress oxydatif, sont des agents endommageant l&#39;ADN et sont importantes dans la progression d&#39;un cancer du colon Acide désoxycholique, un acide biliaire, augmente le stress oxydatif grâce à la génération d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ERO) par plusieurs processus, y compris dommageables de 10 mitochondries. Il ya des preuves récentes que les ROS causer des changements épigénétiques 11, et au moins 15 études ont montré que les acides biliaires, à l&#39;augmentation des concentrations qui accompagne un régime riche en graisses, provoquer des dommages à l&#39;ADN 12. Comme examiné par Bernstein et al. 12, il existe une association positive entre la consommation de graisses alimentaires et l&#39;incidence du cancer du côlon. Les acides biliaires sont sécrétés dans le tractus intestinal en réponse à la graisse dans l&#39;alimentation, et des acides biliaires agissent comme des détergents pour aider à la digestion des graisses. Ainsi, une alimentation riche en graisse est associé à la sécrétion d&#39;acides biliaires augmente. Fécaux concentrations d&#39;acides biliaires sont élevés dans les populations avec une incidence élevée de cancer du côlon, et une exposition excessive aux acides biliaires est considérée comme un facteur de risque majeur pour la cancérogenèse colique 13. Les acides biliaires peut être une cause des anomalies du champ dans le côlon. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Un fission crypte colique en 3 cryptes. Conclusion Nous avons trouvé une fréquence élevée de cryptes déficiente dans les gènes de réparation de l&#39;ADN et de ERCC1 PMS2 (PMS2 est également requise pour l&#39;apoptose) dans les anomalies du champ entourant grande cancers du côlon. Carences en ERCC1 et PMS2 (en raison de modifications épigénétiques ou mutations) peuvent être les premières étapes de l&#39;instabilité génétique au cœur de la progression vers le cancer du côlon.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PMS2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ERCC1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>MS-671-P1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ku86 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotech.</td>
<td>SC-9034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CcO1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>459600</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated secondary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAKO</td>
<td>E0413</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22% BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Informagen, Inc.</td>
<td>2327</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sniper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocare Medical</td>
<td>BS966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectastain ABC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>34001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>20605</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal XYL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48212-196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

deficient pms2, ercc1, ku86, ccoi in field defects during progression to colon cancer

En cancérogenèse, le «défaut de terrain&quot; est reconnu cliniquement en raison de la forte propension des victimes de certains cancers de développer d&#39;autres tumeurs malignes du type même tissu, souvent dans un endroit à proximité. Ces anomalies du champ ont été indiqués dans le cancer du côlon. Les anomalies moléculaires qui sont responsables d&#39;une anomalie du champ dans le côlon doit être détectable à haute fréquence dans le tissu histologiquement normal autour d&#39;un adénocarcinome du côlon ou autour d&#39;un adénome présentant une néoplasie avancée (bien sur la voie à un cancer du colon), mais à basse fréquence dans la muqueuse colique de patients sans néoplasie du côlon. En utilisant l&#39;immunohistochimie, cryptes totalité dans les 10 cm de chaque côté d&#39;adénocarcinomes du côlon ou avancé néoplasies coliques ont été trouvés pour être fréquemment réduite ou absente dans l&#39;expression de deux protéines de réparation de l&#39;ADN, PMS2 et / ou ERCC1. PMS2 est une protéine double rôle, actif dans la réparation de mésappariements de l&#39;ADN ainsi que nécessaires dans l&#39;apoptose des cellules avec des dommages à l&#39;ADN en excès. ERCC1 est actif dans la réparation de l&#39;ADN par excision de nucléotides. L&#39;expression réduite ou absente des deux ERCC1 et PMS2 serait de créer des cellules à la fois avec une capacité accrue pour survivre (résistance à l&#39;apoptose) et augmentation du niveau de la mutabilité. L&#39;expression réduite ou absente des deux ERCC1 et PMS2 est probablement une des premières étapes dans la progression vers le cancer du côlon. Gène Ku86 réparation de l&#39;ADN (actif dans l&#39;ADN non homologue fin de rejoindre) et sous-unité cytochrome c oxydase I (impliqués dans l&#39;apoptose) avaient chacun été signalé à être diminué dans son expression dans les zones proches de la muqueuse du côlon. Toutefois, l&#39;évaluation immunohistochimique de leurs niveaux d&#39;expression ont montré que de faibles fréquences aux modestes de cryptes d&#39;être déficient dans leur expression dans une anomalie du champ entourant le cancer du côlon ou autour avancés néoplasies coliques. Nous montrons, ici, notre méthode d&#39;évaluation des cryptes pour l&#39;expression de ERCC1, PMS2, Ku86 et CCOI. Nous montrons que la fréquence des cryptes toute déficientes pour PMS2 et ERCC1 est souvent plus grande que 70% à 95% dans 20 cm de long zones entourant une néoplasie du côlon, tandis que la fréquence des cryptes déficient en Ku86 a une valeur médiane de 2% et la fréquence des cryptes déficient en CCOI a une valeur médiane de 16% dans ces domaines. La totalité du côlon est de 150 cm de long (environ 5 pieds) et a environ 10 millions de cryptes dans sa couche muqueuse. Le défaut de PMS2 et ERCC1 entourant un cancer du côlon peut donc inclure 1000000 cryptes. Il est d&#39;une crypte défectueux qui pose le cancer du côlon.

Watch this Scientific Journal Video about Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer at JoVE.com

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

Expression réduite / absent du PMS2 et / ou ERCC1 dans des cryptes entière est un événement fréquent dans les 10 cm de chaque côté d&#39;adénocarcinomes du côlon, probablement la base d&#39;une anomalie du champ avec la mutabilité élevée et la progression vers le cancer. La carence en Ku86 ou CCOI est beaucoup moins fréquent dans ces anomalies du champ.

PMS2 insuffisantes, ERCC1, Ku86, CCOI des défauts sur le terrain pendant la progression du cancer du colon

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Implantation de Ferumoxides Étiqueté cellules souches mésenchymateuses humaines dans les lésions du cartilage

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Recherche

Biologie

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Les peptides de la bibliothèque de Phage Display modulent l&#39;expression génétique dans les cellules mésenchymateuses et potentialiser l&#39;ostéogenèse dans des défauts osseux Unicortical

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Détermination de la contribution des systèmes d&#39;énergie pendant l&#39;exercice

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Mesure de la force lors de la contraction d&#39;évaluer la fonction musculaire en poisson zèbre

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Détection de l&#39;épissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Suivi temporel de la progression du cycle cellulaire par cytométrie en flux, sans la nécessité pour la synchronisation

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Le murin déficients en Choline, additionné d’éthionine (CDE) alimentation modèle d’atteinte hépatique chronique

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Évaluation des voies urinaires Junction Obstruction défauts par Injection de colorant de bleu de méthylène

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction ...