Name: deficient pms2, ercc1, ku86, ccoi in field defects during progression to colon cancer
Uploaded: 2010-07-28T17:00:00
Duration: 28 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer at JoVE.com

Finansiering från södra Arizona Veterans Affairs hälsovården VA Merit Review bidrag 0142 och Arizona biomedicinsk forskning kommissionen bevilja 0803.

Förbereda vävnader som ska visas på bilderna <ol><li> En colonoscope kan föras in i tjocktarmen via ändtarmen. En colonoscope är en lång slang som har belysning och en videokamera i spetsen, förmågan passera luft i tjocktarmen att blåsa upp det som en lång ballong för bättre visualisering av tjocktarmen, och har en passage för biopsi tång som kan sträcker sig utanför videokamera att nypa bort en 3-5 millimeter område på insidan &quot;skin&quot; eller slemhinnor skikt av tjocktarmen för att ge oss en biopsi prov. Den biopsi pincett kan också användas för att ta bort potentiellt förstadium till cancer polyper som finns i tjocktarmen. </li><li> Vi fick biopsier av normala kolon slemhinnor vävnad från patienter med informerat samtycke. Dessa patienter genomgick en screening koloskopi i mag-klinik. Vår biopsier placerades i burkar av formalin. Efter 4 timmar var formalin ersättas med 70% alkohol. </li><li> Liknande prover av vävnad togs från områden med kolon fria stationer, tas bort under operationen, som var 1 cm och 10 cm från kolon cancer eller adenom med avancerad neoplasi. Dessa vävnadsprover togs också i formalin, och om vävnadsprover var stora var en del förvaras i formalin under en längre period innan de släpps ut i 70% alkohol. </li><li> Vävnaden prover tas för att en histologi laboratorium för att bearbetas och placeras i paraffinblock. </li><li> Paraffinblock kyls i kylskåp för att göra dem lättare skära av en mikrotomen. </li><li> Vävnadssnitt av 4 micron tjocklek skärs ut från vävnaden block, med en mikrotom, och flöt på vattnet. </li><li> För att jämföra uttrycket av två proteiner, till exempel ERCC1 och Pms2, kan växla vävnadssnitt hämtas upp på två bilder, tills det finns tre vävnad avsnitt om vardera av två bilder. Till exempel kan punkterna 1, 3 och 5 läggas på en bild som heter ERCC1 och avsnitten 2, 4 och 6 kan placeras på en bild som heter Pms2. Med tre vävnadssnitt immunostained för ett protein på en enda bild kan tillåta dig att se om en ovanlig färgning mönster av en krypta är en artefakt eller är verklig, eftersom artefakterna inte skulle upprepas i fler än en vävnad avsnitt på en bild. Colon kryptor är cirka 60 mikrometer i diameter, så att ca 15 vävnadssnitt kan skära genom en krypta, och samma kryptan kan ses på flera vävnadssnitt per bild. </li></ol> Immunfärgning vävnadssnitt <ol><li> Bilderna är sedan sätta genom immunhistokemisk märkning förfarande. Detta är ett 8 timmars förfarande, och är ganska standard. De delar av förfarandet som vi använder, som inte är standard, är användningen av Sequenza behållare för färgning, och användning av en lösning för att minska bakgrundsfärgning heter &quot;Sniper&quot;. Den &quot;Sniper&quot;-lösning säljs som en egen formel genom Biocare Medical, Concord CA. </li><li> Några av stegen i våra rutiner visas här. </li><li> Som ett exempel för Pms2 immunohistokemi, diabilder är första avparaffinerade genom att placera i 3 byten av xylen (3 minuter), följt av två förändringar i 100% etanol (2 minuter), följt av två förändringar i 95% etanol (2 minuter vardera), följt av 2 byten av destillerat vatten (2 minuter). Dessa förfaranden genomförs under en kemisk huva med negativt lufttryck så att försöksledaren inte utsätts för ångor. </li><li> När formalin ursprungligen användes för att fixera vävnaden, blev delar av proteiner i vävnadsprovet korslänkad. Nu måste vi bryta den gränsöverskridande länkar så att en antikropp kan känna igen proteinet av intresse. Bilderna är placerade i en buffertlösning som förs till en koka i mikrovågsugn. Detta följs av 10 minuter på medelhög inställning, följt av kyla i 20 minuter på is. Detta steg måste testas och justeras för olika mikrovågsugn, tills bra resultat uppnås. Observera att för immunfärgning CcOI eller Ku86 vi använt en buffert natriumcitrat gjorts med 9 ml citronsyra + 41mL natriumcitrat + 450 ml H 2 O (en buffert med natriumjoner) som hade ett pH på omkring 6,0, för ERCC1 vi använde en citratbuffert gjort med 2.1g citronsyra + 1 liter H 2 O + ~ 5 ml natriumhydroxid för att få pH till 6,1 (en buffert med minimal tillsats natriumjoner), och för Pms2 använde vi en lösning som gjorts med 5 ml Antigen avslöja lösning (av Vector) + 533mL H 2 O. Olika buffertar behövs för att öka antikroppar interaktion med visst protein epitoper. </li><li> Bilderna är sedan i 3% väteperoxid (utspätt i metanol) i 20 minuter följt av en sköljning i destillerat vatten i 3 minuter och tvättas i fosfatbuffrad-saltlösning (kallas PBS) i 5 minuter. </li><li> Diabilder placeras sedan i platta smala färgning rack kallas Sequenza (Shandon Sequenza immunfärgning System från Thermo Scientific) och sköljas med PBS. </li><li> Bilderna är immunostained för ERCC1 eller Pms2 sedan utsätts för 10 minnuter exponering mot en extra behandling av 3 droppar av en egenutvecklad lösning, från Biocare, som heter &quot;Sniper&quot; som fungerar för att minska icke-specifik färgning av bakgrunden proteiner. </li><li> Bilderna sköljs med en buffert &quot;TBST&quot; som är 1 ml Tween + 100 ml 10x Tris + 900 ml destillerat vatten [där 10x Tris är 24,2 gram Trizma + 80 gram NaCl + 1000 ml destillerat och avjoniserat vatten + koncentrerad HCl (ca 15 ml) för att ge lösningen till pH 7,6]. </li><li> Diabilder är sedan sköljas tre gånger med buffert, och 100 mikroliter av DAKO biotinylerad sekundär antikropp på 1:100 utspädning (i 2% bovint serumalbumin består i buffert TBST) läggs till bilderna och inkuberas i 30 minuter i rumstemperatur. </li><li> Vid denna punkt är Vectastain ABC (Avidin Biotin Complex) (från Vector Laboratories) reagens beredda, med 2,5 ml PBS, 1 droppe lösning A, 1 droppe lösning B, och lösningen får stå i 30 minuter. </li><li> Bilderna sköljs tre gånger med TBST buffert. </li><li> Därefter 3 droppar Vectastain ABC reagens tillsätts och bilderna inkuberas i rumstemperatur i 30 minuter, följt av sköljning två gånger med TBST. </li><li> Diabilder är därefter ned i DAB (diamino-benzamid) (2,9 ml DAB + 400 mikroliter PBS + 250 mikroliter väteperoxid) i ca 5 minuter. </li><li> Bilderna är sedan sköljas två gånger med destillerat, avjoniserat vatten. </li><li> Motfärgning sker med en utspädd lösning av hematoxylin i 10 sekunder. Diabilder sköljs noggrant i kranvatten och därefter avjoniserat vatten. </li><li> Diabilder är då uttorkad 2 gånger i 2 minuter i 95% etanol, 2 gånger i 2 minuter i 100% etanol och 2 gånger i 2 minuter i xylen. </li><li> Ett par droppar Cytoseal XYL (Richard-Allan vetenskapliga) läggs därefter till bilderna och ett täckglas tillämpas. </li><li> Immunhistokemiska utvärdering av ERCC1, Ku86 och CcOI utförs med samma protokoll som för Pms2, men ersätt Pms2 antikropp med antikroppar för ERCC1, Ku86 och CcOI beskrivs i tabellen nedan. </li></ol> Utvärdera vävnadssnitt för kryptor brister i uttryck av ERCC1, Pms2, Ku86 och CcOI <ol><li> Vi ska först titta på vävnadsprov under en Motic (DM-BA300) photomicroscope för uttryck av Pms2 och ERCC1 i kryptor i mukosan i kolon. </li><li> Pms2 och ERCC1 är båda DNA-reparation enzymer, och så de finns där DNA är, i kärnan av celler i kryptor. Detta anges i figur 1, där den bruna kolon representerar färgning för ERCC1 sker i kärnan av celler i en krypta. Den normala kryptan vi visar först i mikroskop färgas för ERCC1, och den bruna fläcken visar var ERCC1. Vi påpekar vilka typer av celler i kryptor, där &quot;pokal celler&quot; är formad ungefär som ett vinglas, med kärnor i en liten region vid foten av de celler i utkanten av kryptan, och en ballong ut avsnitt, fylld med vita mucinet granulat i den del av cellen på insidan av kryptan. De andra två typer av celler ser något lika i våra färgade snitt, och de är de enterocyterna och celler enteroendocrine, och deras kärnor är också vid den yttre kanten av kryptan, vid foten av cellerna. I biopsier från patienter som aldrig haft ett kolon neoplasi, eller i biopsier långt från en webbplats av tjocktarmscancer, nästan alla kärnor i alla kryptor uppvisar normal hög uttryck för ERCC1 som visas här. </li><li> Att orientera våra observationer, vävnadssnitt från biopsier av patienter utan kolon neoplasi observeras för nivåer av uttryck av Pms2, ERCC1, CcOI eller Ku86 i normal mukosan i kolon. Vi kan observera alla kryptor i en normal vävnad avsnitt, med en 40x objektiv, när vi sakta går igenom en hel vävnad avsnitt och peka ut de kryptor, den interstitiella celler, något lymfoida knölar på bilden, och muscularis (om det finns i biopsi). </li><li> Vi pekar också på att det bara är flera celler vid basen av kryptan som är stamceller. Dessa stamceller generera alla de ca 2000 celler av hela kryptan. En stamcell med en mutation eller en epimutation kan ta över hela stamceller nisch. Sedan hela kryptan kan ha ändrat färgning för ett enzym av intresse (crypt konvertering) som vi visar i denna nya bilden där vi ser hela kryptor bristfällig för CcOI bredvid kryptor som har hög uttryck för CcOI. </li><li> Då kan vi visa en bild från en patient med ett kolon cancer eller ett adenom med avancerad neoplasi. På den här bilden, några kryptor har normal hög uttryck för ERCC1 och några har lägre nivåer av uttryck. Alla kryptor i vävnaden avsnittet är fotograferade med låg upplösning med ett 10x objektiv, och bilderna är kaklade så att hela vävnaden avsnittet ses i en bild. Den kryptor Därefter numrerade. </li><li> Den kryptor med hög uttryck av enzymet, typisk för kryptor i biopsier långt tillbakam någon cancer, kallas nivå &quot;4&quot; färgning. Övriga nivåer är &quot;0&quot; om det inte finns uttryck upptäckas, &quot;1&quot; om bara knappt mätbar uttryck är tydlig, &quot;2&quot; om det finns uttryck närvarande, men på en betydligt lägre nivå än nivå 4, och &quot;3&quot; om uttrycket är närvarande på en lägre nivå än 4, men ganska stark. Vi prick varje bild i låg upplösning bilden blå för 4, grönt för 3, gult för 2, orange för en och röd för 0. Här visar vi går igenom ett avsnitt från en biopsi med hjälp av ett 40x objektiv. Vi prick kryptorna på lågupplöst bild. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Ett kolon kryptan visar hög uttryck ERCC1 i kärnan av kryptan celler. Alla färger i denna bild var lika förbättrats på kontrast och färgmättnad med hjälp av Paint Shop Pro 5. Representativa resultat <ol><li> Den alternativa vävnadssnitten på separata bilder tillåter oss att titta på samma kolon kryptor, med uttryck av två olika proteiner som visas av immunohistokemi. Bilden av en krypta färgas för Pms2 och samma kryptan färgas för ERCC1 visas på angränsande mikroskop med intilliggande datorskärmar. Detta tillåter oss att avgöra om det finns gemensam brist för två proteiner eller om bristerna i de proteiner, medan varje är frekvent sker självständigt. Vi har tre vävnadssnitt per bild, så att alla uppenbara brister i uttryck av ett protein kan verifieras som brister på mer än ett avsnitt, och inte på grund av en artefakt. I vävnader omgivande kolon cancer, där det finns ett fält fel som ger upphov till cancer, det finns en hög frekvens av kryptor bristfällig för ERCC1 och Pms2. </li><li> Vi har också använt immunohistokemi för att hitta den frekvens av kryptor bristfällig för Ku86 och CcOI. På den här bilden går vi igenom en hel vävnad avsnitt immunostained för Ku86, med en 40x objektiv, och vi kan se att några kryptor har brist på Ku86 i denna vävnad avsnitt. </li><li> Likaså den här bilden går vi igenom en hel vävnad avsnitt immunostained för CcOI, med en 40x objektiv, och vi kan se att endast ett måttligt antal kryptor är bristfälliga för CcOI. </li></ol>

<ol>
	<li>Slaughter, D. P., Southwick, H. W., Smejkal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+cancerization+in+oral+stratified+squamous+epithelium;+clinical+implications+of+multicentric+origin.">Field cancerization in oral stratified squamous epithelium; clinical implications of multicentric origin.</a> Cancer. 6, 963-968 (1953).</li><li>Vauthey, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+field+cancerisation+in+clinical+oncology.">Importance of field cancerisation in clinical oncology.</a> Lancet Oncol. 1, 15-16 (2000).</li><li>Bernstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+defects+in+progression+to+gastrointestinal+tract+cancers.">Field defects in progression to gastrointestinal tract cancers.</a> Cancer Lett. 260, 1-10 (2008).</li><li>Calabrese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+pretumor+progression+before+and+after+loss+of+DNA+mismatch+repair.">Colorectal pretumor progression before and after loss of DNA mismatch repair.</a> Am J Pathol. 164, 1447-1453 (2004).</li><li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Pms2+expression+in+non-neoplastic+flat+mucosa+from+patients+with+colon+cancer+correlates+with+reduced+apoptosis+competence.">Reduced Pms2 expression in non-neoplastic flat mucosa from patients with colon cancer correlates with reduced apoptosis competence.</a> Appl Immunohistochem Mol Morphol. 14, 166-172 (2006).</li><li>Huang, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+marker+for+normal+and+malignant+human+colonic+stem+cells+(SC)+and+tracks+SC+overpopulation+during+colon+tumorigenesis.">Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells (SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis.</a> Cancer Res. 69, 3382-3389 (2009).</li><li>Kim, K. M., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+reveals+a+niche:+stem+cell+succession+in+human+colon+crypts.">Methylation reveals a niche: stem cell succession in human colon crypts.</a> Oncogene. 21, 5441-5449 (2002).</li><li>Greaves, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+are+established+in+human+colonic+stem+cells,+and+mutated+clones+expand+by+crypt+fission.">Mitochondrial DNA mutations are established in human colonic stem cells, and mutated clones expand by crypt fission.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 714-719 (2006).</li><li>Nara, K., Nagashima, F., Yasui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+elevated+ultraviolet-induced+mutation+frequency+in+isolated+Chinese+hamster+cell+lines+defective+in+nucleotide+excision+repair+and+mismatch+repair+proteins.">Highly elevated ultraviolet-induced mutation frequency in isolated Chinese hamster cell lines defective in nucleotide excision repair and mismatch repair proteins.</a> Cancer Res. 61, 50-52 (2001).</li><li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxycholate+induces+mitochondrial+oxidative+stress+and+activates+NF-kB+through+multiple+mechanisms+in+HCT-116+colon+epithelial+cells.">Deoxycholate induces mitochondrial oxidative stress and activates NF-kB through multiple mechanisms in HCT-116 colon epithelial cells.</a> Carcinogenesis. 28, 215-222 (2007).</li><li>Lim, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+induced+by+reactive+oxygen+species+in+hepatocellular+carcinoma:+methylation+of+the+E-cadherin+promoter.">Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter.</a> Gastroenterology. 135, 2128-2140 (2008).</li><li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+as+carcinogens+in+human+gastrointestinal+cancers.">Bile acids as carcinogens in human gastrointestinal cancers.</a> Mutat Res. 589, 47-65 (2005).</li><li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hydrophobic+bile+acids,+genomic+instability,+Darwinian+selection,+and+colon+carcinogenesis.">hydrophobic bile acids, genomic instability, Darwinian selection, and colon carcinogenesis.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 1, 19-47 (2008).</li></ol>

<ol><li> Det är mycket viktigt att ha 3 vävnadssnitt per bild. Bubblor kan uppstå vid tillämpningen av media bär antikroppar, så att vissa kryptor eller delar av kryptor inte får färgas tillräckligt bara för att en bubbla hindrade antikroppar från att reagera med vävnaden avsnitt. Kryptor är cirka 60 mikrometer i diameter, och vävnadssnitt är 4 mikrometer tjock, så det kan finnas så många som 15 vävnadssnitt genom samma krypta. Det är oftast möjligt att hitta samma krypta, med hjälp av morfologi av kryptan som guide, på flera vävnadssnitt placeras i en bild. </li><li> I våra senaste studier, för stora vävnadsprover kan färgning i en Sequenza inte ge bra antikropp täckning till vävnaden. I dessa fall kan man föredrar att använda handen färgning av vävnad, där en droppe av media som innehåller antikroppen hand placeras över varje vävnadsprov. </li><li> Att tydligt se de bruna fläckar som visar uttryck av immunostained protein, och den blå färgning visar nukleärt DNA på datorskärmen är Motic photomicroscope programvaran anpassas enligt följande: Gain 0, Offset 0, Förbättra 0, 255, Gamma 1,00, 0, Skärpa 1, färgkorrigering 7, R, G, B Gain 1,00 och R, G, B Ljusstyrka 0. Upplösningen är inställd på 1024 x 768 och vitbalans är aktiverad. </li><li> Vår metod kan användas med alla proteiner tros vara viktiga i progression till tjocktarmscancer, för att bedöma deras frekvens av brist, eller möjligen överuttryck, i fält defekter omgivande kolon cancer eller adenom med avancerad neoplasi. </li><li> Fält defekter är en del av progression till cancer Termen &quot;fältet cancerization&quot; användes först av Slaughter et al. 1953 en för att beskriva ett område eller &quot;fält&quot; av epitel som har konditionerats med i stort sett okända processer (på den tiden) så att predisponera det mot utvecklingen av cancer. Den ursprungliga användning var i samband med orala cancerformer. Sedan dess har begreppen &quot;fältet cancerization&quot; och &quot;fältet defekt&quot; använts mer allmänt för att beskriva alla premaligna vävnad där nya cancerformer är mer sannolikt att uppstå, och begreppet fältet cancerization i klinisk onkologi har fått allt större uppmärksamhet 2 . Vi granskade nyligen bevis för fältet fel i mag-tarmcancer 3. Inkluderat i denna översyn av resultaten av ett tiotal studier som ger belägg för fältet defekter i tjocktarmen. Fält defekter i kolonmukosa uppstår sannolikt genom naturligt urval av muterade celler eller epigenetiskt förändrade celler bland stamceller i en krypta så att en stamcell överlever 4 nisch följd. Genetisk instabilitet eller en Mutator fenotyp, kanske på grund av minskning av DNA-nukleotid excision reparation eller DNA mismatch reparation, skulle påskynda denna process (och ofta fel i Pms2 tidigare rapporterats i områden runt kolon cancer 5). Om det i en normal population av stamceller i kolonmukosa, förvärvar en cell en selektiv fördel genom en mutation eller en epimutation, kommer det tenderar att expandera kloner på bekostnad av närliggande stamceller. I kolonmukosa är stamceller nisch upptas av ≤ 5 celler 6 som sedan ger upphov till alla (cirka 2.000) cellerna i kryptan. Ett övertagande av stamceller nisch av en muterad eller epigenetiskt förändrat resultat celltyp i &quot;crypt omvandling&quot; 7. Spridningen av muterade kloner (omräknat kryptor) i kolon epitelet kan oftast ske genom kryptan fission 8. Ett exempel på crypt fission visas i Figur 2. På detta sätt ett plåster i onormal vävnad uppstår. Inom en sådan lapp, kan en andra sådan mutation sker så att en viss krypta förvärvar en fördel jämfört med andra kryptor i plåstret, och detta crypt kommer att expandera kloner som bildar en sekundär patch inom den ursprungliga patchen. Inom denna nya patch, kan processen upprepas flera mer tid, kanske under årtionden, tills en malign stamceller uppstår ur kloner som expanderar till en cancer. Om detta är den allmänna process genom vilken sporadiska kolon adenocarcinom uppkommer, då kolon adenocarcinom i allmänhet bör förknippas med, och föregås av, områden abnormitet. Alltså en lapp av konverterade kryptor kan förväntas ha påvisbara defekter i området kring ett adenom med avancerad neoplasi, eller kring en tjocktarmscancer. Från denna modell före tumörprogression, skulle man förvänta sig att hitta genetiska eller epigenetiska förändringar med anknytning till före tumörprogression hos vävnadsprover som tagits från den icke-neoplastiska kolonmukosa i områden kring neoplastiska förändringar i tjocktarmen som kan utvecklas till cancer . Framför allt skulle defekter i enzymer DNA-reparation, eller i proteiner som behövs för apoptos, bidra till progression genom att öka genomisk instabilitet, och kan förväntas finnas i ett defekt område. </li><li> Urval till brist på Pms2 när celler är deficient för ERCC1 och utsätts för en DNA-skada agent Nara et al. 9 blev 25 kulturer av kinesisk hamsteräggceller 43-3B, alla med en mutation inaktivera genen DNA-reparation ERCC1, och behandlade kulturer med ett DNA-skada agent, MNNG. Bland de celler överlever behandlingen DNA-skador, var en enda cell isolerad från varje kultur och får bilda en klon. Alla isolerade klonerna var cirka 10-faldig mer motståndskraftiga mot dödandet av MNNG än moderstammen. Av de isolerade klonerna var 22 visat sig vara defekta i DNA mismatch reparation (MMR). Fem av dessa 22 kloner testades av sekvensering, och tre av de fem var bristfälliga för Pms2. Detta urval för fel i Pms2 var förmodligen därför Pms2 brist orsakat resistens mot apoptos och därmed förmåga att överleva den ökade DNA-skador som finns kvar i cellerna när ERCC1 var frånvarande. (Normalt Pms2 sinnen DNA-skador nivåer, och gör att cellerna att genomgå apoptos vid DNA-skador är överdriven.) Således är en brist i Pms2 utvalda för när ERCC1-brist celler utsätts för DNA-skador. Kloner defekt i både ERCC1 och Pms2 visade sig ha om en 500 till 1000 gånger större mutationshastighet när bestrålat med UV än föräldrarnas celler. </li><li> Gallsyror orsaka oxidativ stress, är DNA-skada agenter och är viktiga i progression till tjocktarmscancer Desoxicholsyra syra, en gallsyra, ökar oxidativ stress genom produktion av reaktiva syreradikaler (ROS) av flera processer, inklusive skada på mitokondrier 10. Det är de senaste bevis för att ROS orsakar epigenetiska förändringar 11 och minst 15 studier har visat att gallsyror, vid ökade koncentrationer medföljer en fettrik kost, ge DNA-skador 12. Som granskats av Bernstein et al. 12, det finns ett positivt samband mellan fett konsumtion och tjocktarmscancer incidens. Gallsyror utsöndras i mag-tarmkanalen som svar på fett i kosten, och gallsyror fungera som rengöringsmedel för att stöd i matsmältningen av fett. Således är en fettrik kost i samband med ökad galla syrasekretionen. Fekal gallsyror koncentrationerna är förhöjda i populationer med hög förekomst av tjocktarmscancer, och överdriven exponering för gallsyror betraktas som en viktig riskfaktor för kolon cancer 13. Gallsyror kan vara en orsak till fält defekter i tjocktarmen. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Ett kolon kryptan fissioning i 3 kryptor. Slutsats Vi fann en hög frekvens av kryptor brist på gener DNA-reparation ERCC1 och Pms2 (Pms2 krävs också för apoptos) i stora fält defekter omgivande kolon cancer. Brister i ERCC1 och Pms2 (på grund av epigenetiska förändringar eller mutationer) kan vara tidiga steg i den genetiska instabilitet centrala för progression till tjocktarmscancer.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PMS2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ERCC1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>MS-671-P1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ku86 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotech.</td>
<td>SC-9034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CcO1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>459600</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated secondary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAKO</td>
<td>E0413</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22% BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Informagen, Inc.</td>
<td>2327</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sniper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocare Medical</td>
<td>BS966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectastain ABC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>34001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>20605</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal XYL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48212-196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

deficient pms2, ercc1, ku86, ccoi in field defects during progression to colon cancer

I cancer, är det &quot;fältet defekt&quot; erkänt kliniskt på grund av hög benägenhet för överlevande från vissa cancerformer för att utveckla andra maligniteter av samma vävnadstyp, ofta i en närliggande plats. Sådana fält fel har indikerats i tjocktarmscancer. Den molekylära avvikelser som är ansvariga för ett fält fel i tjocktarmen bör upptäckas i hög frekvens i histologiskt normalt vävnaden som omger ett kolon adenocarcinom eller omgivande ett adenom med avancerad neoplasi (på god väg till en tjocktarmscancer), men vid låga frekvenser i kolonmukosa från patienter utan kolon neoplasi. Använda immunohistokemi, var hela kryptor inom 10 cm på varje sida av kolon adenocarcinom eller avancerad kolon neoplasier visat sig vara ofta minskas eller frånvarande i uttrycket för två proteiner som DNA-reparation, Pms2 och / eller ERCC1. Pms2 är en dubbel roll protein, aktiv i DNA mismatch reparation samt behövs i apoptos i celler med överskott DNA-skador. ERCC1 är aktiv i DNA-nukleotid excision reparation. Den försvagade eller uteblir uttryck av både ERCC1 och Pms2 skulle skapa celler med både ökad förmåga att överleva (apoptos motstånd) och ökad grad av föränderlighet. Den försvagade eller uteblir uttryck av både ERCC1 och Pms2 är sannolikt ett tidigt steg i progression till tjocktarmscancer. DNA-reparation gen Ku86 (aktiv i DNA icke-homologa slut att gå) och cytokrom c oxidas subenhet I (involverad i apoptos) hade varje rapporterats vara minskat i uttryck i slemhinnor områden nära kolon cancer. Visade dock immunhistokemisk bedömning av deras nivåer av yttrandefrihet bara låg till måttlig frekvenser på kryptor som brister i sitt uttryck i ett fält fel kring koloncancer eller omgivande avancerat kolon neoplasi. Vi visar här, vår metod för utvärdering av kryptor för uttryck av ERCC1, Pms2, Ku86 och CcOI. Vi visar att frekvensen av hela kryptor bristfällig för Pms2 och ERCC1 är ofta så stor som 70% till 95% på 20 cm lång områdena kring ett kolon neoplasi, medan frekvensen av kryptor brist på Ku86 har ett medianvärde på 2% och frekvensen av kryptor brist på CcOI har ett medianvärde på 16% inom dessa områden. Hela tjocktarmen är 150 cm lång (ca 5 meter) och har cirka 10 miljoner kryptor i slemhinnor lager. Felet i Pms2 och ERCC1 kring en tjocktarmscancer vilket kan omfatta en miljon kryptor. Det är från en defekt crypt att tjocktarmscancer uppstår.

Watch this Scientific Journal Video about Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer at JoVE.com

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

Minskad / frånvarande uttryck för Pms2 och / eller ERCC1 i hela kryptor är en vanlig händelse inom 10 cm på varje sida av kolon adenocarcinom, sannolikt med stöd av ett fält fel med höga mutability och progression till cancer. Brist på Ku86 eller CcOI är mycket mindre vanligt i dessa fält defekter.

Bristfälligt Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI i Field defekter under Progression till tjocktarmscancer

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Implantation av Ferumoxides Märkta mänskliga mesenkymala stamceller i brosk fel

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Peptider från Phage Display Library modulera genuttryck i mesenkymala celler och potentiera Osteogenesis i Unicortical bendefekter

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Fastställande av bidrag Energy Systems under träning

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snabb genetisk analys av Epithelial-mesenkymala Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Force Measurement under kontraktion att bedöma muskelfunktion i zebrafisk larver

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Upptäckt av alternativ splits Under Epithelial-Mesenkymala Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Temporal Spårning av cellcykelprogression med användning av flödescytometri utan behov av synkronisering

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Den murina kolin-brist, Ethionine-kompletteras (CDE) kost modell av kronisk leverskada

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Bedömningen av urinvägarna Junction obstruktion defekter av metylenblått Dye injektion

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction ...