Name: preparation of developing and adult drosophila brains and retinae for live imaging
Uploaded: 2010-03-15T17:55:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Welch Foundation (I-1657) en het NIH (RO1EY18884). PRH is een Eugene McDermott Scholar in biomedisch onderzoek.

1. Introductie In deze video, zullen we laten zien hoe je Drosophila hersenen en retinae voor te bereiden op live-beeldvorming en immunohistochemie met een focus op fotoreceptorcellen. Eerst zullen we zien hoe voor te bereiden op de hersenen dissecties. Vervolgens zullen we zien twee fundamentele dissecties vaak gebruikt voor immunohistochemie dat de basis voor de live voorbereidingen te vormen. Deze twee preparaten zijn de volwassen hersenen en ogen dissecties. Vervolgens zullen we demonstreren de dissecties gebruikt voor live beeldvorming van de volwassenen en het ontwikkelen van de hersenen met de nadruk op hun gebruik voor live beeldvorming van fotoreceptoren. Tot slot beschrijven we hoe we foto levend weefsel en tonen enkele voorbeelden van live-imaging met behulp van resonante confocale microscopie. 2. Dissection voorbereiding <ol><li> Voor een goede dissecties, moet je scherpe tang. Gebruik van een aanzetstaal blok of zeer fijn schuurpapier (&gt; 1500), voorzichtig langs de tang heen en weer op elke kant totdat de eindjes aan elkaar op een fijne punt. We maken gebruik van een standaard slijpsteen. We zullen niet voor de verscherping techniek hier, maar er rekening mee dat scherp forceps essentieel zijn voor live dissecties. We slijpen tang voor elke dissectie. </li><li> Voor de volwassen hersenen dissecties, plaats de vliegen op een CO 2 pad om ze te verdoven en te sorteren op de gewenste genotype. Voor pupal dissecties, eenvoudig te bereiken in de flacon en voorzichtig een pop te verwijderen met uw tang, en let om te voorkomen dat het breken van de popstadium geval. </li><li> Bevochtig een Kimwipe met water. U gebruikt deze tijdens de dissectie om vuil te verwijderen van uw tang. Plaats een dissectie schotel op het toneel van een stereoscoop en vul deze met HL3 oplossing 1. Alle dissecties zal worden uitgevoerd in HL3 om ervoor te zorgen dat het weefsel blijft levend en gezond tijdens de dissectie procedure. Ook maken we gebruik van een dissectie schotel die een bodem bedekking van Sylgard om verlostang te beschermen tijdens de dissectie heeft. </li><li> Nu bereiden de vaststelling oplossing als u van plan bent immunohistochemie uit te voeren. Plaats 180μL van HL3 in een 500μL microcentrifugebuis. Voeg 20μL van 37% formaldehyde aan een 3,7% formaldehyde-oplossing te verkrijgen. </li><li> Tot slot, de juiste houding van de handen is belangrijk voor een goede dissecties. Met een goede positie van de hand, zal je pincet gelijkmatig zijn en in staat van gecontroleerde, subtiele bewegingen. Plaats eerst de tang aan de zijkant van je duim. Breng dan de wijsvinger recht naar beneden, zodat het topje van de vinger rust op de top. Nu rest de zijkant van de tang aan de zijkant van je middelvinger en naar de dissectie schotel. Maak lichamelijk contact met het gerecht door uw duim en middelvinger. Tijdens het rusten uw duim en middelvinger op de schotel, plant je pols op de microscoop podium. Op deze manier heb je drie punten stevig op oppervlakken tijdens de dissectie en het is nu mogelijk om zeer subtiele manipulaties van de tang. Deze techniek kan een beetje ongemakkelijk te voelen op het eerste, maar met de praktijk, zult u binnenkort een meester van de hersenen dissecties. </li></ol> 3. Volwassen hersenen <ol><li> Op de CO 2-pad, oriënteren een volwassen vlieg buikzijde met het hoofd uit de buurt van je hand. Pak de borstkas net onder de kop. Als dit goed wordt gedaan, zal de benen en proboscis uit te breiden. Tijdens het bekijken onder een stereoscoop, pak de verlengde snuit met de tang aan het hoofd te verwijderen. Gooi het lichaam en onder water het hoofd. Heroriënteren op de verzonken kop. De hele dissectie zal worden uitgevoerd onder oplossing. Het is zeer belangrijk om op de kop te houden met een tang te allen tijde. Anders zal het hoofd zweven en is moeilijk te halen. Als het hoofd beweegt niet scherp tijdens de dissectie, gewoon terug naar het in het brandvlak, zonder het aanpassen van de microscoop. Deze schijnbaar eenvoudige taak kan moeilijk zijn op het eerste, maar waarbij je je hoofd in focus zal makkelijker in de tijd. </li><li> Begin de dissectie door eerst te scheuren het bindweefsel tussen de proboscis en het oog. Scheur door het oog terwijl u stevig met ten minste een pincet te allen tijde. Zeker te zijn dat de teen van de tang alleen is net onder het netvlies of de nagelriem, om te voorkomen dat schade aan de hersenen eronder. Afwisselend links en rechts, gebruik je tang te scheuren weg het netvlies, werken aan de achterkant van het hoofd. Scheuren weg het netvlies zal de kans dat de lamina blijft verbonden aan de optische lob in deze dissectie. Ga verder rond de achterkant van het hoofd, scheuren cuticula langs de weg. Scheur door het andere oog en beginnen wegrijden cuticula. Zolang je grijpen nagelriem, u weet dat u niet het pletten van de hersenen! Met dit in gedachten, nog steeds cuticula en het netvlies weg te trekken tot aan de hersenen is onthuld. </li><li> Zodra de hersenen zichtbaar is, kunt u beginnen met het verwijderen luchtpijp aan de hersenen (Fig. 1A). Verder te trekken in luchtpijp en cuticula totdat de hersenen is geïsoleerd. Op dit punt moet je concentreren op de bodem van de schotel voor thij de resterende stappen. Verwijder de resterende luchtpijp, omdat je hersenen anders kan drijven tijdens de nacht antilichaam wasbeurten. Voor de beeldvorming van fotoreceptor terminals, is het wenselijk om de lamina behouden, maar je moet het netvlies, die de cellichamen en sterk autofluorescente pigment bevat te verwijderen. Om dit te doen, trek aan de bossige en gepigmenteerde cellulaire blijft zonder beschadiging van de lamina. Dit is een fijner vaardigheid en vergt oefening. </li><li> De volwassen hersenen levend gehouden kan worden voor de uren of zelfs dagen onder omstandigheden die we zullen bespreken in hoofdstuk 6. Voor immunohistochemie, het volwassen brein is nu klaar om te worden vastgesteld in formaldehyde. 2 Gebruik een P20 pipetteman ingesteld om 5μL de volwassen hersenen te verplaatsen naar de vaststelling oplossing die u al hebt voorbereid. Ga verder ontleden volwassen hersenen gedurende 20 minuten, dat moet 40 tot 10 hersenen opleveren. Laat de hersenen in de oplossing voor een extra 40 minuten, maar dit duur kan variëren voor een optimaal primair antilichaam kleuring. Verwijder de formaldehyde-oplossing en spoel de hersenen drie keer voor vijf minuten elk in 400μL van een oplossing die PBS en 0,4% TritonX-100, hierna te noemen PBS-Triton. Na het volledig wassen van de fix oplossing, kunt u toevoegen primair antilichaam oplossing. </li></ol> 4. Volwassen ogen <ol><li> Begin deze dissectie zoals beschreven voor de volwassen hersenen. Na het onderdompelen van het hoofd en de heroriëntering van de microscoop, beginnen met het scheuren van het bindweefsel tussen de proboscis en het oog. Boven de snuit, scheid de cuticula van het oog. Nu, los van de cuticula van de onderkant van het oog, werken aan de achterkant van het hoofd. Met een pincet, pak het midden van de achterkant van het hoofd. Met de andere, pak het oog en trekken. Laat het oog om zich te vestigen op de bodem van de schaal (Fig. 1B). De lamina zal waarschijnlijk nog worden bevestigd aan het oog en kan gebruikt worden voor live beeldvorming van de terminals van volledig intact fotoreceptorcellen op dit moment. Om door te gaan met live in beeld brengen van fotoreceptorcel lichamen, gaat u naar sectie 4.5. De volgende drie hoofdstukken uit te leggen vaste oog immunohistochemie. </li><li> Voor immunohistochemie, verplaats het oog op de vaststelling van oplossing met behulp van een P20 pipetteman ingesteld op 5μL. Ga verder ontleden volwassen ogen voor een totaal van 10 minuten. Laat de ogen in oplossing voor een extra 30 minuten. Verwijder de fix-oplossing en het gedrag wast, zoals beschreven in het volwassen brein dissectie. </li><li> Als u uiteindelijk wilt het imago van de ommatidial structuur van het oog van de lamina moet nu verwijderd worden. Zet de vaste ogen om je ontleden schotel en verwijder de luchtpijp of vet cellen die nog kunnen worden verbonden. Vervolgens terwijl de buitenkant van het oog met een tang, verwijder de lamina met de andere. Het moet uit te komen in een stuk, waardoor de cellbodies onder (Fig. 1B). Wees voorzichtig om de lamina alleen pakken! Anders loop je het risico verwijderen van de fotoreceptoren van het netvlies. </li><li> Met behulp van een P20 pipetteman, verplaatst u de ogen om 400uL PBS-Triton in een 500uL buis. Voorzichtig ze &#39;s nachts rots bij 4 graden ten opzichte van de autofluorescente rode pigment van de fotoreceptoren te verwijderen. De volgende dag, kunt u gooi de wasoplossing en voeg primair antilichaam oplossing. </li><li> Voor de live-imaging van volwassen ogen gebruiken we alleen pharate volwassen vliegen, dat wil zeggen laat stadium poppen kort voor Eclosion. In dit stadium, de fotoreceptorcel instanties die losstaan ​​van terminals in de lamina tijdens de dissectie. </li><li> Pharate volwassen poppen hebben goed gedefinieerde vleugels, ogen, en cuticula zichtbaar door de popstadium geval. Selecteer een pop en verwijder het voorste deel van het popstadium zaak naar het hoofd gebied bloot te leggen. Verwijder voorzichtig het dunne binnenste membraan dat bovendien omsluit de zich ontwikkelende vliegen. Pak de onderkant van het hoofd met je pincet en trek. Gooi de rest van de pop terwijl de kop onder water. </li><li> Ga te werk zoals aangetoond in het oog dissectie voor immunohistochemie. Op de pharate volwassen stadium, echter, zal de fotoreceptorcel lichaam gemakkelijker los te maken van de lamina, waardoor u het imago van de cellichamen gelegen in het netvlies. Ook de lamina blijft aan de optische kwab, zodat u het imago van de distale lamina. Als u het imago van de proximale lamina, waar de fotoreceptor terminal cartridges kunnen worden gezien, voer dan de ogen dissectie op een volwassen vlieg waar de lamina is meer sterk gehecht aan het oog. </li></ol> 5. Het ontwikkelen van eye disc-brain complexen <ol><li> De zich ontwikkelende oog schijf op 20% popstadium ontwikkeling (P +20%) is uitgegroeid tot een favoriet voor live-imaging in ons lab, omdat deze enkele laag van relatief grote ontwikkelingslanden cellen is makkelijk waarneembaar met behulp van confocale microscopie. 3 </li><li> Het selecteren van een 20% pop, kijk voor de malpighian tubuli, een groene vlek verschijnt onder de pupal geval is, en vermijden poppen die een &#39;donkere lichaam &quot;4 hebben. Na het selecteren van een P +20% pop, onderdompelen in HL3 in uw ontleden schotel en verwijder voorzichtig een voorste deel van het popstadium zak, en letniet aan de dunne binnenste membraan dringen. Pak de binnenste membraan met je pincet en uit elkaar te trekken. </li><li> Zorgvuldig zoeken in de vrijgekomen inhoud aan de zich ontwikkelende hersenen en ogen schijven die zijn vrij prominent (Fig. 1C) te vinden. Het oog disc-brein-complex is gemakkelijk uit elkaar in deze fase van de metamorfose. Isoleer de hersenen op de bodem van de schotel ontleden. Haal voorzichtig de centrale hersenen van de optische lob. De optische lob / eye disk zal worden gebruikt in live beeldvorming. </li></ol> 6. Live-Imaging: Bij de microscoop <ol><li> Wilt u de afbeelding voor een een korte tijd in slechts een of twee oplossingen, kunt u het beeld van uw weefsel op een glasplaatje. In dit geval, bereiden de glijbaan door eerst het bekleden van het oppervlak met Sylgard met behulp van instructies van de fabrikant. Plaats 20μL HL3 in het midden van de dia. Vervoer uw ontleed weefsel in 20 extra ui van HL3 aan de dia. Het weefsel moet NOOIT worden blootgesteld aan lucht. Daarnaast moet elke stress of spanning uit pipet behandeling of oplossing oppervlaktespanning worden vermeden. </li><li> Voor live imaging, moet het weefsel stevig worden vastgezet met een minimale behandeling en contact. We stevig de hersenen met behulp van de water-polymerisatie van chirurgische lijm GluShield toegepast door middel van een micro-elektrode positie, een techniek die routinematig gebruikt voor de embryonale voorbereidingen voor elektrofysiologie 5. Verkrijgen van een glaselektrode zoals die getrokken voor elektrofysiologische opnames. Breek de tip en vul het einde met GluShield met behulp van negatieve luchtdruk die door de mond. Breek alleen genoeg van de elektrode die lijm kan komen. Gebruik nu de positieve druk om een ​​kleine hoeveelheid lijm van toepassing op de Sylgard onder een daling van HL3. Nu, snel in het weefsel op de lijm, het handhaven van de gewenste richting voor live imaging. Een water-immersie lens kan nu gebruikt worden voor de beeldvorming. Wilt u een membraan permeabel kleurstof toe te voegen, kunt u deze toevoegen aan het bad, terwijl beeldvorming. </li><li> We maken gebruik van een Resonant scanning confocale microscoop die snelle beeldvorming maakt met een verminderde fotobleken. 6 Voor beeldvorming over lange perioden van tijd of te wisselen oplossingen volledig of meerdere keren, gebruiken we een perfusie kamer (Harvard IC30 confocale imaging kamer) die wordt aangesloten op een peristaltische pomp dat perfuses langzaam kweekoplossing over het levend weefsel (Fig. 2A). Beweging van een constante uitwisseling vloeistof en een minimum aan GluShield contact verminderen van de afvlakking van het weefsel dat werd gemeten over een langere periode 7. Merk op dat voor de beeldvorming van ontwikkelings-perioden, de ogen disc-hersenen complex moet blijven intact en dient minimaal contact met de lijm te hebben. </li><li> Gebruik een dekglas bedekt met een druppel Sylgard dat is geschoren te maken te dun en plat. Verdeel 20μL HL3 op het midden van het dekglaasje en lijm het levend weefsel van de Sylgard. Genereer een pakking die het mogelijk maakt bellen om door de kamer gaan zonder het blootstellen van het levend weefsel in de lucht (Fig. 2B). De pakking moet dik genoeg zijn om te voorkomen dat het neerslaan van de weefsels, maar dun genoeg om het weefsel dicht bij de confocale microscoop lens te brengen; we gebruiken 250μm in onze setup. Monteer de perfusie kamer, let daarbij goed op het weefsel volledig onder water te allen tijde te houden. In eerste instantie beginnen perfusie met een snelheid dicht bij 100μL per minuut met behulp van een peristaltische pomp. Deze snelheid is vrij snel, afhankelijk van de pakking dikte die de kamer hoogte definieert. Voor de beeldvorming op de schaal van uren, kan het nodig zijn 20-hydroxyecdyson en antibiotica, maar niet antifungale toe te voegen, en perfusie presteren op veel lagere snelheden rond 10μl per minuut. Ten slotte hebben we bubble zuurstof in het kweekmedium dat de perfusie kamer levert. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: Aan het einde van onze video-protocol tonen we een voorbeeld voor live imaging in de ontwikkeling van fotoreceptorcellen met behulp van de voorbereiding gepresenteerd in hoofdstuk 5. Deze voorbereiding maakt gebruik van Drosophila transgenese tot cel-specifiek express fluorescerende verslaggevers. In het voorbeeld zijn twee TL-reporters uitgedrukt onder controle van de fotoreceptor-specifieke GMR-Gal4 driver 8: het membraan-gelabeld myrRFP en de endosomale marker 2xFYVE-GFP 9. Twee-kanaals 3D-datasets met een selectiekader van 70x70x17.5μm en een voxel grootte van 137x137x700nm (512x512x26) werden verkregen elke 1 minuut. De film toont een geselecteerde vlak na verloop van tijd in deze 4D dataset dat de dynamiek van intracellulaire endosomale mensenhandel en blaasje fusie gebeurtenissen onthult. Representatieve beelden voor vaste weefsel voorbereidingen van het oog en de lamina worden getoond in Fig. 3.

<ol>
	<li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions.">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li><li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system.">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li><li>Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+lobe+development.">Optic lobe development.</a> Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).</li><li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+-+A+Laboratory+Handbook.">Drosophila - A Laboratory Handbook.</a> , (2005).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRT+letter:+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching.">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69, 689-692 (2006).</li><li>Ayaz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila.">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87 (4), 651-660 (1996).</li><li>Wucherpfennig, T., Wilsch-Brauninger, M., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Drosophila+Rab5+during+endosomal+trafficking+at+the+synapse+and+evoked+neurotransmitter+release.">Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release.</a> J Cell Biol. 161, 609-624 (2003).</li><li>Merzlyak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=monomeric+red+fluorescent+protein+with+an+extended+fluorescence+lifetime.">monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime.</a> Nat Methods. 4 (7), 555-557 (2007).</li><li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly.">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36 (3), 463-474 (2002).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Cooper, M. T., Bray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frizzled+regulation+of+Notch+signalling+polarizes+cell+fate+in+the+Drosophila+eye.">Frizzled regulation of Notch signalling polarizes cell fate in the Drosophila eye.</a> Nature. 397 (6719), 526-530 (1999).</li><li>Cook, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+subtype+specification:+from+flies+to+humans.">Photoreceptor subtype specification: from flies to humans.</a> Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).</li><li>Gurskaya, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaoptin,+a+cell+surface+glycoprotein+required+for+Drosophila+photoreceptor+cell+morphogenesis,+contains+a+repeat+motif+found+in+yeast+and+human.">Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human.</a> Cell. 52 (2), 291-301 (1988).</li><li>Richardt, A., Rybak, J., Stortkuhl, K. F., Meinertzhagen, I. A., Hovemann, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebony+protein+in+the+Drosophila+nervous+system:+optic+neuropile+expression+in+glial+cells.">Ebony protein in the Drosophila nervous system: optic neuropile expression in glial cells.</a> J Comp Neurol. 452 (1), 93-102 (2002).</li><li>Beronja, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+function+of+Drosophila+Sec6+in+apical+exocytosis+of+epithelial+photoreceptor+cells.">Essential function of Drosophila Sec6 in apical exocytosis of epithelial photoreceptor cells.</a> J Cell Biol. 169 (4), 635-646 (2005).</li><li>Mehta, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Drosophila+sec15+reveal+a+function+in+neuronal+targeting+for+a+subset+of+exocyst+components.">Mutations in Drosophila sec15 reveal a function in neuronal targeting for a subset of exocyst components.</a> Neuron. 46 (2), 219-232 (2005).</li></ol>

Fluorescerende probes gebruikt voor beeldvorming Hier beschrijven we de sterke punten en beperkingen van het Drosophila visuele systeem voorbereiding voor een selectie van fluorescerende probes uit drie klassen: (1) Probes die worden toegevoegd aan een levend weefsel voorbereiding van exogeen, (2) fluorescerende eiwitten die genetisch gecodeerd zijn voor zowel live als vaste beeldvorming, (3) fluorescente kleurstoffen die worden toegevoegd aan vaste weefsel voor immunohistochemie. 1. Exogene probes: Lysotracker Green NS-26 of Red NS-99 (Invitrogen, Inc) Deze zijn in de handel verkrijgbaar fluorescente membraan-doorlaatbare stoffen die zich ophopen in sterk aangezuurd compartimenten in de cel, het meest opvallend lysosomen, late endosomen, en autofagosomen. Lysotracker bij nanomolaire concentraties (we gebruiken meestal 50 nM) dringt in de L3-en P +20% eye-schijf volledig in minder dan een minuut. Sinds Lysotracker accumuleert continu en oefent een alkalizing effect, we beeld in minder dan 5 minuten. In tegenstelling tot het oog schijven, is Lysotracker niet doordringen tot de hersenen, zonder verstoring van het weefsel. Echter, een zorgvuldige scheuren van de buitenste membraan laat penetratie van een enkele cel diameters in de optische lob. Lysosensor NS-189 (Invitrogen, Inc) In tegenstelling tot Lysotracker, Lysosensor niet ophopen in aangezuurd compartimenten, maar vertoont verhoogde fluorescentie bij zure pH. Lysosensor heeft penetratie kenmerken die erg lijken op Lysotracker. We maken gebruik van Lysosensor bij een concentratie van 1 uM. 2. Genetisch gecodeerd probes: Voor veel live-imaging experimenten, drukken we genen gelabeld met verschillende fluorescente moleculen zoals GFP, TagRFP 10 of de pH-gevoelige pHluorin 11 onder controle van het binaire Gal4/UAS expressiesysteem 12. GAL4-lijnen die te uiten in het ontwikkelen van fotoreceptoren onder andere GMR-Gal4 (alle fotoreceptoren) 8 en mDelta0.5-Gal4 (de ontwikkeling van R4 en R7) 13. Een aantal subtype-specifieke Gal4-driver lijnen bestaan ​​die maken gebruik van verschillende rhodopsine promotors 14. Vooral nuttig fluorescerende probes in live imaging zijn photoconvertible eiwitten. We hebben met succes gebruikt Dendra2, een monomere groen-to-rood photoconvertable eiwit 15. Merk op dat Dendra2 is ontworpen om te worden photoconvertible met behulp van een 488nm Argon laser lijn. Maar we zijn niet in staat om de conversie te bereiken met behulp van zichtbaar blauw licht met behulp van onze set-up in beide conventionele of resonant confocale scanning modus. In tegenstelling, conversie met 405 nm UV-laser is efficiënt. 3. Immunohistochemie: Voor de vaste volwassen oog, we vaak kiezen voor rhodamine phalloidin (Invitrogen, Inc), of anti-Chaoptin (een fotoreceptor-specifiek antilichaam 16) tot rhabdomeric structuur (figuur 1A) te visualiseren. Een goede manier om lamina cartridge structuur te analyseren is het combineren van anti-chaoptin 16, de gliale marker anti-ebbenhout 17, en anti-sec6 18 (figuur 1B). Zoals getoond in Fig. 3, deze combinatie van antilichamen onderscheidt de grote presynaptische (chaoptin) en postsynaptische (sec6) processen evenals epitheel glia (ebbenhout) in de lamina 19. Montage van de Perfusie Kamer Voor live imaging, gebruiken we een perfusie kamer die langzame uitwisseling van oplossingen kan zonder verstoring van het weefsel voorbereiding. Een demonstratie van perfusie kamer assemblage is opgenomen in de video-en schematisch weergegeven in figuur 2. Vergadering van de perfusie kamer wordt geïllustreerd in Fig. 2A. Begin met het leggen van de pakking weer het monster eerst en ga dan verder met de montage zoals afgebeeld. Het doel van de pakking is het creëren van een ruimte tussen de onderkant van de kamer en het deksel, een ruimte waarbinnen het weefsel is verzegeld en waardoor de oplossing zal vloeien. De ruimte binnen in de pakking moet de inlaat (oplossing komt hier), het weefsel prep, en de uitlaat waardoor de oplossing verlaat de kamer. Twee kenmerken van de pakking zijn van cruciaal belang: Ten eerste, de pakking moet nog dik genoeg zijn voor de hersenen dun genoeg om beeldvorming mogelijk is met een hoge-resolutie-lens. De ideale pakking dikte is afhankelijk van set-up-specifieke parameters. Ten tweede, een inkeping in de pakking zorgt voor een compartiment die het mogelijk maakt een zeepbel te passeren zonder contact met het monster (afb. 2B). Beeldvorming bij de microscoop We maken gebruik van een 63x (diafragma 1.3) glycerine onderdompeling lens voor de perfusie kamer of een 63x onderdompeling in water lens direct in het kweekmedium op een dia. Glycerine lenzen bieden meer werkafstand dan olie lenzen. We maken gebruik van een resonerende scanning confocale microscoop die scant op veel hogere snelheden dan een conventionele scanner (8000 Hz ten opzichte van 1400 Hz, respectievelijk). Resonant scanning maakt drie-dimensionale opnames loop van de tijd bij hogeER frame rates. Bovendien sneller scannen snelheden aanzienlijk verminderen laser fototoxiciteit 6 dat is een grote zorg voor herhaalde scans van levend weefsel. Een balans van laser intensiteit en PMT voltage (winst) moeten worden bereikt om het signaal te maximaliseren terwijl het minimaliseren van geluid en fotobleking. Een belangrijke verdere overweging is dat de hoeveelheid laser impact op een bepaalde regio wordt bepaald door de resolutie en zoom. Bijvoorbeeld, is een regio van keuze gescand met dezelfde resolutie op 256x256, zoom 2x zo op 512x512, zoom 1x, maar de maximaal mogelijke live-imaging snelheid is vier keer sneller op 256x256, zoom 2x. Voor het opnemen van de activiteit van snel bewegende intracellulaire compartimenten, hebben we met succes opgenomen met de volgende instellingen: 5 frames per z-stack met een snelheid van een z-stack per 10 seconden met een scansnelheid van 8000 Hz en 2x lijn gemiddeld. Voor lange beeldvorming sessies op de schaal van uren, we vaak vermindering van de frame rate tot een per enkele minuten en kies voor grotere gebieden als de voorbereiding is meer kans op verschuiven. Drosophila Visual System Anatomy Figuur 3 toont de anatomie van de Drosophila volwassen oog (Fig. 3A), de volwassen hersenen (fig. 3B), en de 20% -25% popstadium oog schijf / hersenen complex (fig. 3C). Figuur 3A illustreert de volwassen ogen zowel met als zonder de lamina en de bijgevoegde vetcellen. Tijdens de volwassen oog dissectie, de lamina, die in het midden van het oog genesteld in een kom gevormd door de fotoreceptorcel organen (links), moet worden verwijderd zonder verstoring van de cellichamen onder (rechts). Voor de volwassen hersenen dissectie, moet men in staat zijn om de fotoreceptorcel lichamen, de lamina, de optische kwab, de centrale hersenen en luchtpijp (fig. 3B) te onderscheiden. De fotoreceptoren en de luchtpijp moet worden verwijderd voor deze dissectie, terwijl de lamina aan de optische lob. Om te helpen bij de identificatie van de 20-25% popstadium oog schijf / hersenen complex, is een live beeld weergegeven in figuur 3C. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. (A) volwassen hersenen. (B) volwassen oog. (C) 20% -25% popstadium eye-disc/brain complex. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. (A) Perfusie kamer montage en (B) pakking positionering ten opzichte van het monster. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. (A) Adult rhabdomere kleuring met behulp van anti-chaoptin. (B) Adult lamina kleuring met behulp van anti-chaoptin (groen, fotoreceptoren), anti-ebony (rood, glia) en sec6 (blauw, interneuronen).

Special Equipment: <ol><li> Dissection Scope: Leica Mz12.5 met digitale camera </li><li> Leica TCS SP5 Confocale Tandem-Scanner Microscoop voor conventionele en resonante scannen leven imaging microscopy, waaronder blauw (488nm), groen (561nm), oranje (594nm) en ver-rood (633nm), lasers en speciale 63x, 1,4 glycerine en een 63x, 1,3 onderdompeling in water lenzen. </li><li> Harvard Instrumenten Confocale Imaging Kamer RC-30 en de peristaltische pomp model 720 </li><li> Sutter Pipetteer trekker P-97 </li><li> Software: Amira 5.2, Visage Imaging </li></ol>

preparation of developing and adult drosophila brains and retinae for live imaging

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Hersenen en het visuele systeem worden veel gebruikt model systemen om neuronale ontwikkeling, functie en degeneratie te bestuderen. Hier laten we drie bereidingen van de hersenen en het visuele systeem, dat het bereik van de zich ontwikkelende oog disc-hersen-complex in de ontwikkelingslanden poppen aan individuele ogen en de hersenen dissectie van volwassen vliegen te dekken. Alle protocollen zijn geoptimaliseerd voor de live-cultuur van de voorbereidingen. Echter, presenteren we ook de voorwaarden voor vaste weefsel immunohistochemie waar van toepassing. Ten slotte tonen we leven imaging voorwaarden voor het gebruik van deze voorbereidingen conventionele en resonante 4D confocale leven beeldvorming in een perfusie kamer. Samen vormen deze protocollen bieden een basis voor het live-beeld op verschillende tijdschalen variërend van functionele intracellulaire assays op de schaal van minuten tot ontwikkelings-of degeneratieve processen op de schaal van vele uren.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging at JoVE.com

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Dit protocol beschrijft drie<em&gt; Drosophila</em&gt; Voorbereiding: 1) volwassen hersenen dissectie, 2) volwassen netvlies dissectie en 3) het ontwikkelen van eye-schijf-hersen-complexen dissectie. De nadruk wordt gelegd op speciale voorbereiding technieken en voorwaarden voor de live-imaging, maar alle voorbereidingen kunnen worden gebruikt voor vaste weefsel immunohistochemie.

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila Poppen

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

De voorbereiding van Drosophila Embryo&#39;s voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffine ingebedde en vriescoupes van Drosophila Adult Spieren

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Live-Imaging van de Cel Extrusie van de opperhuid van de ontwikkelingslanden zebravis

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

De voorbereiding van Adult Drosophila Ogen voor Thin Sectioning en microscopisch onderzoek

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Voorbereiden Individuele Drosophila Egg Chambers voor Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Imaging leven van GFP-gemerkte eiwitten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...