Name: preparation of developing and adult drosophila brains and retinae for live imaging
Uploaded: 2010-03-15T17:55:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag från Welch Foundation (I-1657) och NIH (RO1EY18884). PRH är en Eugene McDermott Scholar inom biomedicinsk forskning.

1. Inledning I den här videon kommer vi att demonstrera hur man förbereder Drosophila hjärnor och retinae för live imaging och immunhistokemi med fokus på ljusmätare celler. Först kommer vi att visa hur man kan förbereda sig för hjärnan dissektioner. Därefter kommer vi att visa två grundläggande dissektioner som vanligen används för immunohistokemi som ligger till grund för levande förberedelser. Dessa två preparat är den vuxna hjärnan och dissektioner ögat. Därefter kommer vi att demonstrera dissektioner används för levande avbildning av den vuxna och utveckla hjärnan med betoning på deras användning för live avbildning av fotoreceptorer. Slutligen kommer vi att beskriva hur vi bilden levande vävnad och visar några exempel på live-avbildning med resonant konfokalmikroskopi. 2. Dissection förberedelse <ol><li> För god dissektioner behöver du skarp pincett. Med hjälp av en skärpning block eller mycket fin sand papper (&gt; 1500), försiktigt förbi pincett och tillbaka på varje sida tills de slutar träffas på en fin spets. Vi använder en standard Slipsten. Vi kommer inte att täcka skärpning tekniken här, men observera att vassa pincett är väsentliga för live dissektioner. Vi vässar pincett innan varje dissekering. </li><li> För vuxna hjärnan dissektioner, placera flugor på en CO 2-pad att söva dem och sortera ut önskad genotyp. För PUPP-dissektioner, enkelt nå in i flaskan och dra försiktigt bort en puppa med pincett, försiktigt för att undvika att bryta PUPP-fallet. </li><li> Fukta en Kimwipe med vatten. Du kommer att använda detta under dissekering för att ta bort skräp från din pincett. Placera en dissekera maträtt på scenen av en stereoskopet och fyll den med HL3 lösning 1. Alla dissektioner kommer att genomföras i HL3 att se till att vävnaden är fortfarande levande och friska under dissekering förfarandet. Dessutom använder vi en dissektion maträtt som har en botten som täcker av Sylgard att skydda pincett under dissekering. </li><li> Nu förbereder fastställande lösningen om du planerar att utföra immunohistokemi. Plats 180μL av HL3 i ett 500μL mikrocentrifugrör. Tillsätt 20μL 37% formaldehyd för att få en 3,7% formaldehyd lösning. </li><li> Slutligen är korrekt handställning viktigt för ett gott dissektioner. Med bra hand positionen, kommer din pincett vara stadig och kan kontrolleras, subtila rörelser. Först, placera pincett på sidan av tummen. Sedan föra pekfingret rakt ner så att spetsen på fingret vilar på toppen. Nu resten sidan av pincetten på sidan av långfingret och gå vidare till dissekering skålen. Gör fysisk kontakt med skålen med tummen och långfingret. Samtidigt vilar tummen och långfingret på skålen, växt handleden på mikroskop scenen. På så sätt har du tre poäng stadigt på ytor under dissekering och det är nu möjligt att göra mycket subtila manipulationer av peang. Denna teknik kan kännas lite konstigt i början, men med övning kommer du snart att vara en mästare på hjärnan dissektioner. </li></ol> 3. Vuxna hjärnan <ol><li> På CO 2 pad, orientera en vuxen fluga ventralsidan upp med huvudet bort från handen. Ta tag i bröstkorgen precis under huvudet. Om det görs på rätt sätt kommer ben och snabel förlänga. När du tittar på under en stereoskopet, greppa den utökade snabel med din tång för att ta bort huvudet. Kasta kroppen och dränka huvudet. Åter fokusera på nedsänkt huvud. Hela dissektion kommer att utföras under lösning. Det är mycket viktigt att hålla fast huvudet med pincett hela tiden. Annars kommer huvudet flyter och är svår att hämta. Om chefen flyttar ut ur fokus under dissektionen, helt enkelt flytta tillbaka in i fokalplanet utan att justera mikroskopet. Denna till synes enkla uppgift kan vara svårt i början, men att hålla huvudet i fokus kommer att bli lättare med tiden. </li><li> Börja dissektion genom att först riva bindväven mellan snabel och ögat. Riv genom ögat och håll fast med minst en pincett vid alla tillfällen. Var säker på att tån på pincetten är bara strax under näthinnan eller nagelband, för att undvika skador på hjärnan under. Omväxlande vänster och höger, använd din pincett att slita bort näthinnan, som arbetar mot baksidan av huvudet. Riva bort näthinnan kommer att öka chanserna att lamina sitter kvar på synnerven lob hela denna dissektion. Fortsätt runt nacken, river nagelband längs vägen. Riv genom det andra ögat och börja dra bort nagelbanden. Så länge du är ta tag nagelband, du vet att du inte krossa hjärnan! Med detta i åtanke, fortsätter att dra nagelband och näthinna borta tills hjärnan är avslöjade. </li><li> När hjärnan är synlig, kan du börja att ta bort luftstrupen knutna till hjärnan (Fig. 1A). Fortsätt att dra i luftstrupen och nagelband tills hjärnan är isolerad. I detta läge bör du fokusera på undersidan av skålen för tHan återstående stegen. Ta bort de kvarvarande luftstrupen eftersom din hjärna annars kan flyta under natten antikropp tvättar. För avbildning av fotoreceptor terminaler är det önskvärt att behålla lamina, men du måste ta bort näthinnan, som innehåller cellen organ och starkt autofluorescent pigment. För att göra detta drar du försiktigt på den yviga och pigmenterad cellulära kvar utan att skada lamina. Detta är en finare skicklighet och kräver övning. </li><li> Den vuxna hjärnan kan hållas vid liv i timmar eller dagar med förhållanden som vi kommer att diskutera i avsnitt 6. För immunohistokemi är den vuxna hjärnan nu redo att fastställas i formaldehyd. 2 Använd en P20 pipetteman satt till 5μL att flytta den vuxna hjärnan fastställande lösning som du redan har förberett. Fortsätt att dissekera vuxna hjärnan i 20 minuter, vilket bör ge 40-10 hjärnor. Lämna hjärnan i fix för ytterligare 40 minuter, men denna tid kan variera för optimal primär antikropp färgning. Ta bort formaldehyd lösningen och tvätta hjärnan 3 gånger i 5 minuter vardera i 400μL av en lösning innehållande PBS och 0,4% TritonX-100, nedan kallat PBS-Triton. Efter att helt skölja fix-lösning, kan du lägga till primär antikropp lösning. </li></ol> 4. Vuxen öga <ol><li> Börja här dissekering som beskrivits för den vuxna hjärnan. Efter att dränka huvudet och fokusering i mikroskop, börja med att riva bindväven mellan snabel och ögat. Ovanför snabel, separat nagelbanden från ögat. Nu separera nagelband från undersidan av ögat, som arbetar mot baksidan av huvudet. Med en pincett, ta tag i mitten av bakhuvudet. Med den andra, ta tag i ögat och dra. Låt ögat att avgöra till botten av skålen (bild 1B). Lamina kommer förmodligen ändå knytas till ögat och kan användas för live avbildning av terminalerna helt intakt fotoreceptor celler vid denna tid. För att fortsätta med levande avbildning av fotoreceptor cellens organ, gå till avsnitt 4.5. De följande tre avsnitten beskriver fast öga immunohistokemi. </li><li> För immunohistokemi, flytta ögat att fastställa med hjälp av en P20 pipetteman inställd på 5μL. Fortsätt att dissekera vuxna ögon för totalt 10 minuter. Låt ögonen fix för ytterligare 30 minuter. Ta bort fix-lösning och genomföra tvättar som beskrivs i den vuxna hjärnan dissekering. </li><li> Om du slutligen vill att bilden ommatidial struktur i ögat lamina måste tas bort nu. Återgå fast ögonen för din dissekera skålen och ta bort eventuella luftstrupen eller fettceller som fortfarande kan fästas. Därefter Håll utsidan av ögat med en pincett, ta bort lamina med den andra. Det borde inte komma bort i ett stycke, utsätta cellbodies undersidan (Fig. 1B). Var noga med att greppa lamina bara! Annars riskerar du loss fotoreceptorer från näthinnan. </li><li> Med hjälp av en P20 pipetteman, flytta ögonen 400uL PBS-Triton i en 500uL rör. Skaka dem på 4 grader över natten för att ta bort autofluorescent röda pigment från fotoreceptorer. Följande dag, kan du kassera tvättlösningen och tillsätt primära antikroppen lösning. </li><li> För levande avbildning av vuxna ögon vi bara använder pharate vuxna flugor, det vill säga sent stadium puppor strax före eclosion. I detta skede av ljusmätare cellen organ som är åtskilda från terminalerna i lamina under dissekering. </li><li> Pharate vuxna puppor har väldefinierade vingar, ögon och nagelband synliga genom PUPP-fallet. Välj en puppa och ta bort den främre delen av PUPP-fallet att exponera huvudet regionen. Ta försiktigt bort den tunna inre membran som dessutom omsluter utveckla flyga. Ta basen i huvudet med pincett och dra. Släng resten av puppan och samtidigt hålla huvudet under vatten. </li><li> Gör som visats i ögat dissektion för immunohistokemi. På pharate vuxna stadiet, kommer dock ljusmätare cellen organ lossnar lättare från lamina, så att du bild cellen organ inbäddat i näthinnan. Dessutom kvarstår lamina bifogas synnerven lob, så att du kan bild distala lamina. Om du vill att bilden proximala lamina, där ljusmätare terminalen patroner kan ses, utför sedan ögat dissektion på en vuxen fluga där lamina är starkt knutna till ögat. </li></ol> 5. Utveckling av eye-skiva-hjärna komplex <ol><li> Utvecklingsländerna ögat skivan med 20% PUPP-utveckling (P 20%) har blivit en favorit för live imaging i vårt labb, eftersom det enda lager av relativt stora utveckla cellerna är lätt att observera med hjälp av konfokalmikroskopi. 3 </li><li> För att välja ett 20% puppa, leta efter malpighian tubuli, en grön fläck på visas under PUPP-fallet, och undvika puppor som har ett &quot;mörkt kropp&quot; 4. Efter du valt en P 20% puppa, dränka den i HL3 i din dissekera skålen och dra försiktigt bort ett främre delen av PUPP-säck, var försiktiginte att tränga igenom tunna inre membran. Ta tag i inre membranet med din pincett och dra isär. </li><li> Försiktigt söka igenom släppt innehållet för att hitta den växande hjärnan och skivor ögat som är ganska framträdande (bild 1C). Ögat DISC-hjärna komplex är lätt separeras i detta skede av metamorfos. Isolera hjärnan i botten av dissekera skålen. Separera försiktigt centrala hjärnan från synnerven lob. Den optiska lob / öga disk kommer att användas i levande bilder. </li></ol> 6. Live Imaging: I mikroskop <ol><li> Om du vill på bilden för en kort tid i endast en eller två lösningar, kan du bild din vävnad på en glasplatta. I detta fall förbereda bilden genom att först belägga ytan med Sylgard enligt tillverkarens anvisningar. Placera 20μL HL3 i mitten av bilden. Transportera dissekerade vävnad i ytterligare 20 mikroliter av HL3 till bilden. Vävnaden får aldrig utsättas för luft. Dessutom måste någon stress eller påfrestningar från pipett hantering eller lösningen ytspänning undvikas. </li><li> För levande bilder, måste vävnaden sättas fast med minimal hantering och kontakt. Vi säkert läge hjärnan med hjälp av vatten-polymerisation kirurgiskt lim GluShield tillämpas genom en mikroelektrod, en teknik som används rutinmässigt för embryonala förberedelser för elektrofysiologi 5. Skaffa en glaselektrod som de dragit för elektrofysiologiska inspelningar. Bryt av toppen och fyll slutet med GluShield med negativt lufttryck som genereras av munnen. Bryt bara tillräckligt av elektroden att limmet kan komma in. Använd nu positivt tryck för att tillämpa en liten mängd lim till Sylgard under en droppe HL3. Nu kan snabbt aktivera vävnad på limmet, upprätthålla den önskade inriktningen för live avbildning. En vatten-immersion-objektiv kan nu användas för avbildning. Om du vill lägga till ett membran genomsläpplig färg kan du lägga till det i badet medan avbildning. </li><li> Vi använder en Resonant Scanning konfokalmikroskop som tillåter snabb avbildning med nedsatt fotoblekning. 6 för avbildning under lång tid eller att utbyta lösningar helt eller flera gånger, vi använder en perfusion kammare (Harvard IC30 konfokala imaging avdelningen) som ansluts till en Slangpumpar att perfuses långsamt kultur lösning över levande vävnad (Fig. 2A). Förflyttning av konstant flytande valuta och minimal GluShield kontakta minska flackare vävnad som har observerats under längre tidsperioder 7. Observera att för avbildning av utvecklingsstörningar tidsperioder, behöver ögat skivan-hjärna komplex för att förbli intakt och bör ha minimal kontakt med lim. </li><li> Använd ett lock slip belagd med en droppe Sylgard som rakat att det blir tunt och platt. Tillsätt 20μL HL3 på mitten av täckglas och limma levande vävnad till Sylgard. Generera en packning som gör att bubblorna att passera genom kammaren utan att utsätta levande vävnad till luft (Fig. 2B). Packningen måste vara tillräckligt tjockt för att undvika att krossas vävnaden men tunn nog för att få vävnaden nära konfokalmikroskop lins, vi använder 250μm i vår inställning. Montera perfusion kammaren, var noga med att hålla vävnaden helt under vatten hela tiden. Börja perfusion initialt till en ränta nära 100μL per minut med en peristaltiska pumpar. Denna hastighet är ganska snabbt beroende på packningen tjockleken som definierar kammaren höjd. För avbildning på skalan timmar, kanske du behöver lägga till 20-hydroxyecdysone och antibiotika, men inte svampdödande, och utföra perfusion till mycket lägre hastigheter runt 10μl per minut. Slutligen har vi bubbla syre i substratet som levererar perfusion kammaren. </li></ol> 7. Representativa resultat: I slutet av vår video-protokollet visar vi ett exempel för live-avbildning i utvecklingen fotoreceptor celler med förberedelserna presenteras i avsnitt 5. Detta preparat tar fördel av Drosophila genmodifiering till cell-specifikt uttryck för fluorescerande reportrar. I det visade exemplet är två fluorescerande reportrar uttryckt under kontroll av fotoreceptor-specifika GMR-Gal4 föraren 8: membran-taggade myrRFP och endosomal markör 2xFYVE-GFP 9. Två-kanals 3D-dataset med en markeringsramen för 70x70x17.5μm och en Voxel storlek 137x137x700nm (512x512x26) erhölls var 1 min. Filmen visar en vald plan över tiden i denna 4D dataset som visar dynamiken i intracellulära endosomal människohandel och vesikler händelser fusion. Bilderna är för fast vävnad beredningar av ögat och lamina visas i figur. 3.

<ol>
	<li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions.">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li><li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system.">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li><li>Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+lobe+development.">Optic lobe development.</a> Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).</li><li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+-+A+Laboratory+Handbook.">Drosophila - A Laboratory Handbook.</a> , (2005).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRT+letter:+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching.">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69, 689-692 (2006).</li><li>Ayaz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila.">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87 (4), 651-660 (1996).</li><li>Wucherpfennig, T., Wilsch-Brauninger, M., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Drosophila+Rab5+during+endosomal+trafficking+at+the+synapse+and+evoked+neurotransmitter+release.">Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release.</a> J Cell Biol. 161, 609-624 (2003).</li><li>Merzlyak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=monomeric+red+fluorescent+protein+with+an+extended+fluorescence+lifetime.">monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime.</a> Nat Methods. 4 (7), 555-557 (2007).</li><li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly.">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36 (3), 463-474 (2002).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Cooper, M. T., Bray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frizzled+regulation+of+Notch+signalling+polarizes+cell+fate+in+the+Drosophila+eye.">Frizzled regulation of Notch signalling polarizes cell fate in the Drosophila eye.</a> Nature. 397 (6719), 526-530 (1999).</li><li>Cook, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+subtype+specification:+from+flies+to+humans.">Photoreceptor subtype specification: from flies to humans.</a> Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).</li><li>Gurskaya, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaoptin,+a+cell+surface+glycoprotein+required+for+Drosophila+photoreceptor+cell+morphogenesis,+contains+a+repeat+motif+found+in+yeast+and+human.">Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human.</a> Cell. 52 (2), 291-301 (1988).</li><li>Richardt, A., Rybak, J., Stortkuhl, K. F., Meinertzhagen, I. A., Hovemann, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebony+protein+in+the+Drosophila+nervous+system:+optic+neuropile+expression+in+glial+cells.">Ebony protein in the Drosophila nervous system: optic neuropile expression in glial cells.</a> J Comp Neurol. 452 (1), 93-102 (2002).</li><li>Beronja, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+function+of+Drosophila+Sec6+in+apical+exocytosis+of+epithelial+photoreceptor+cells.">Essential function of Drosophila Sec6 in apical exocytosis of epithelial photoreceptor cells.</a> J Cell Biol. 169 (4), 635-646 (2005).</li><li>Mehta, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Drosophila+sec15+reveal+a+function+in+neuronal+targeting+for+a+subset+of+exocyst+components.">Mutations in Drosophila sec15 reveal a function in neuronal targeting for a subset of exocyst components.</a> Neuron. 46 (2), 219-232 (2005).</li></ol>

Fluorescerande prober används för avbildning Här beskriver vi de styrkor och begränsningar av Drosophila visuella systemet förberedelse för ett urval av fluorescerande prober från tre klasser: (1) sonder som läggs till en levande vävnad förberedelse exogent, (2) fluorescerande proteiner som är genetiskt kodade för både live och Fast imaging, (3) fluorescerande färger som läggs till fast vävnad för immunohistokemi. 1. Exogena sonder: Lysotracker Grön DND-26 eller Red DND-99 (Invitrogen, Inc.) Dessa är kommersiellt tillgängliga fluorescerande membran som släpper igenom ämnen som ackumuleras i starkt försurad fack i cellen, framförallt lysosomer, sen endosomes och autophagosomes. Lysotracker på nanomolära koncentrationer (vi använder vanligtvis 50 nM) penetrerar L3 och P 20% ögat skiva helt på mindre än en minut. Sedan Lysotracker ackumuleras kontinuerligt och utövar ett alkaliseringsmedel effekt, vi bilden på mindre än 5 minuter. I motsats till ögat skivor, tränger Lysotracker inte hjärnan utan avbrott i vävnaden. Dock medger noggrann riva av den yttre membran penetration av ett fåtal celler diameter i synnerven lob. Lysosensor DND-189 (Invitrogen, Inc.) I motsats till Lysotracker, inte Lysosensor inte ackumuleras i syrad fack, men uppvisar ökad fluorescens vid surt pH. Lysosensor har penetrationen egenskaper som är mycket lik Lysotracker. Vi använder Lysosensor vid en koncentration av 1μM. 2. Genetiskt kodade sonder: För många Bildproduktion experiment, uttrycker vi gener märkta med olika fluorescerande molekyler som GFP, TagRFP 10 eller pH-känsliga pHluorin 11 under kontroll av de binära Gal4/UAS expressionssystem 12. Gal4-linjer som uttrycker att utveckla fotoreceptorer inkluderar GMR-Gal4 (alla fotoreceptorer) 8 och mDelta0.5-Gal4 (utveckla R4 och R7) 13. Flera subtyp-specifika Gal4-driver linjer existerar som använder olika Rhodopsin initiativtagare 14. Särskilt bra fluorescerande prober i levande avbildning är photoconvertible proteiner. Vi har framgångsrikt använt Dendra2, en monomer grön till röd photoconvertable protein 15. Observera att Dendra2 är avsedd att vara photoconvertible med en 488nm Argon laser linje. Dock kan vi inte uppnå konvertering med synligt blått ljus med hjälp av vår inställning i antingen traditionell eller resonant konfokal skanning läge. Däremot är konvertering med 405nm UV-laser effektiv. 3. Immunohistokemi: För den fasta vuxna ögat, väljer vi ofta antingen Rhodamine phalloidin (Invitrogen, Inc.) eller anti-Chaoptin (en ljusmätare-specifik antikropp 16) för att visualisera rhabdomeric struktur (Fig. 1A). Ett bra sätt att analysera strukturen lamina patronen är att kombinera anti-chaoptin 16, gliaceller markör anti-ebenholts 17, och anti-sec6 18 (Fig. 1B). Som visas i figur. 3, skiljer denna kombination av antikroppar de stora presynaptiska (chaoptin) och postsynaptiska (sec6) processer samt epiteliala Glia (ebenholts) i lamina 19. Montering av perfusion avdelningen För levande avbildning, använder vi en genomblödning kammare som gör att långsamma utbyte av lösningar utan att störa den vävnad förberedelse. En demonstration av perfusionen kammare montering ingår i video och schematiskt visas i figur 2. Montering av perfusionen kammaren visas i fig. 2A. Börja med att lägga packningen över provet först, och sedan fortsätta med monteringen som visas. Syftet med packningen är att skapa ett utrymme mellan botten av kammaren och locket, ett utrymme där vävnad är förseglade och genom vilken lösning som kommer att flöda. Utrymmet inne i packningen måste innehålla inloppet (lösning in här), vävnaden prep, och utloppet genom vilken lösning som lämnar kammaren. Två funktioner i packningen är kritiska: Först måste packningen vara tillräckligt tjock för hjärnan men tunt nog att tillåta avbildning med hög upplösning lins. Den idealiska packningen tjocklek beror på set-up-specifika parametrar. För det andra ger ett hack i packningen ett fack som gör att en bubbla att passera utan att kontakta prov (Fig. 2B). Imaging vid Mikroskop Vi använder en 63x (bländare 1,3) glycerin nedsänkning objektiv för perfusion kammare eller en 63x vattennedsänkningsprovning objektivet direkt i substratet i en bild. Glycerin linser ger mer arbetsavstånd än olja linser. Vi använder en resonant scanning konfokalmikroskop som skannar i mycket snabbare takt än en vanlig scanner (8000 Hz kontra 1400 Hz, respektive). Resonant scanning gör 3-dimensionella inspelningar med tiden vid snabbER bildhastighet. Dessutom, snabbare scanna hastighet avsevärt minska laser fototoxicitet 6 som är ett stort bekymmer för upprepade genomsökningar av levande vävnad. En balans av laser intensitet och PMT spänning (vinst) måste uppnås för att maximera signal samtidigt minimera buller och fotoblekning. En viktig ytterligare övervägande är att mängden av laser påverkan på en viss region bestäms av upplösning och zoom. Till exempel är en region i valet skannas på samma upplösning på 256x256, zoom 2x per 512x512, zoom 1x, men den maximalt möjliga Bildproduktion hastighet är 4 gånger snabbare på 256x256, zoom 2x. För att spela in aktiviteten av snabbrörliga intracellulära fack, har vi spelade framgångsrikt med följande inställningar: 5 bilder per z-stack med en hastighet av ett z-stack per 10 sekunder med en skanningshastighet på 8000 Hz och 2x linje genomsnitt. För långa avbildning sessioner på skalan timmar minskar vi ofta bildfrekvensen till en per flera minuter och välja större områden som beredningen är mer sannolikt att skifta. Drosophila Visual System Anatomi Figur 3 visar anatomi Drosophila vuxna ögat (Fig. 3A), den vuxna hjärnan (Fig. 3B), och 20% -25% PUPP-ögon-skiva / hjärnans komplexa (Fig. 3C). Figur 3A visar vuxna ögat både med och utan lamina och fett bifogade celler. Under den vuxna ögat dissektion,, laminan, som är i mitten av ögat inbäddat i en skål bildas av ljusmätare cellen organ (till vänster) måste avlägsnas utan att störa cellens organ under (höger). För den vuxna hjärnan dissektion ska man kunna skilja de photoreceptor cellen organ, lamina, synnerven lob, centrala hjärnan, och luftstrupe (Fig. 3B). Den fotoreceptorer och luftstrupe måste tas bort för denna dissektion samtidigt som lamina bifogas optisk lob. För att underlätta identifieringen av 20-25% PUPP-ögon-skiva / hjärnan komplex, är en levande bild som presenteras i figur 3C. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. (A) vuxna hjärnan. (B) vuxna ögat. (C) 20% -25% PUPP-eye-disc/brain komplex. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. (A) perfusion kammare montering och (B) packningen positionering i förhållande till provet. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. (A) Vuxen rhabdomere färgning med anti-chaoptin. (B) Vuxen lamina färgning med anti-chaoptin (grön, fotoreceptorer), anti-ebenholts (röd, Glia) och sec6 (blå, interneuron).

Specialutrustning: <ol><li> Dissection Omfattning: Leica Mz12.5 med digitalkamera </li><li> Leica TCS SP5 Confocal Tandem-skanner Mikroskop för konventionell och resonant skanning leva imaging mikroskopi, inklusive blå (488nm), grön (561nm), orange (594nm) och långt rött (633nm) lasrar samt särskilda 63x, 1,4 glycerin och en 63x, 1,3 vatten linser nedsänkning. </li><li> Harvard Instrument Confocal Imaging avdelningen RC-30 och peristaltiska pumpmodell 720 </li><li> Sutter Pipettera avdragaren P-97 </li><li> Programvara: Amira 5,2, Visage Imaging </li></ol>

preparation of developing and adult drosophila brains and retinae for live imaging

Den<em&gt; Drosophila</em&gt; Hjärna och visuella systemet är allmänt används modellsystem för att studera nervsystemets utveckling, funktion och degeneration. Här visar vi tre beredningar av hjärnan och visuella system som omfattar hela skalan från utvecklingsländerna ögat disc-hjärna komplex i utvecklingsländerna puppor till enskilda ögat och hjärnan dissektion från vuxna flugor. Samtliga protokoll är optimerade för den levande kulturen i förberedelserna. Men presenterar vi också förutsättningarna för fixerat immunohistokemi i förekommande fall. Slutligen visar vi lever imaging förutsättningar för dessa preparat med konventionell och resonant 4D konfokala Bildproduktion i en perfusion kammare. Tillsammans utgör dessa protokoll ge en grund för live-avbildning på olika tidsskalor, från funktionell intracellulära analyser i skala minuter till utveckling eller degenerativa processer på skalan av många timmar.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging at JoVE.com

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Detta protokoll beskriver tre<em&gt; Drosophila</em&gt; Beredningar: 1) vuxna hjärnan dissektion, 2) vuxna näthinnan dissektion och 3) utveckla öga disc-hjärna komplex dissekering. Tonvikten läggs på speciella förberedelser tekniker och för levande avbildning, även om alla förberedelser kan användas för fast vävnad immunohistokemi.

Beredning av Utveckla och vuxna Drosophila Brains och retinae för Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Primär Neuronal kulturer från hjärnan hos sent stadium Drosophila puppor

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Beredningen av Drosophila Embryon för Live-Imaging Använda droppe protokollet

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoskopisk Fluorescens Tomografi för In-vivo Imaging för att utveckla Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live avbildning av Drosophila melanogaster Embryonala Hemocyte Flyttningar

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffininbäddade och frysta snitt av Drosophila Vuxen Muskler

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Bildproduktion för cell Extrudering från överhuden av utvecklingsländer Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Beredning av vuxna Drosophila Ögon för Thin Sektionering och mikroskopisk analys

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Framställning av individuella Drosophila Egg Chambers för Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live avbildning av GFP-märkta proteiner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocyter

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...