Name: microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism
Uploaded: 2010-12-22T17:00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por uma doação do MRC.

1. Acasalamento e coleta de ovos <ol><li> Medaka feminino e masculino podem ser facilmente distinguidas pelo tamanho e forma das barbatanas dorsal e anal. As barbatanas anal dos machos são maiores e em forma de paralelogramo comparada com a das fêmeas. A barbatana anal do sexo feminino é menor e em forma triangular. A barbatana dorsal do sexo masculino tem um entalhe claramente visível profunda entre os dois últimos raios. </li><li> Medaka colocar até 40 ovos todos os dias e as fêmeas carregam os ovos medaka agrupado em sua barriga por filamentos de ligação para várias horas antes de serem arrancados de plantas no tanque. </li><li> Fêmeas pode ser pego em uma rede mantido dentro suavemente de ambos os lados por um lado. Os ovos podem ser suavemente arreliado da barriga com o dedo indicador da outra mão. A fêmea pode então ser devolvido ao tanque. Os ovos devem ser transferidos para uma placa de Petri 6 centímetros cheia de mídia embrião por fórceps sem corte ou um dedo. </li><li> Pares Medaka raramente luta quando eles são mantidos em uma caixa pequena de acasalamento. Portanto, eles podem ser mantidos em um pequeno tanque com fluxo de água para que possam ser alimentados e os ovos podem ser coletados a partir do mesmo par todos os dias por um par de meses. </li><li> É importante que os peixes fêmeas não devem ser mantidos sem machos, uma vez que a ovulação ocorre todos os dias em medaka fêmeas. Caso contrário, as fêmeas não podem entregar os ovos e tornar-se indisposto. </li></ol> 2. Embriões de limpeza <ol><li> Transferência unclustered ovos com uma pipeta de vidro a lixa (P2000 tamanho do grão, à prova d&#39;água) colocado na tampa de uma placa de Petri nove centímetros. Remova o meio de excesso, mas garantir um volume suficiente permanece como para evitar a secagem de embriões. </li><li> Rolo delicadamente sobre embriões lixa usando o dedo indicador, aplicando o mínimo de pressão e manter paralelo dedo para a superfície do papel de areia por cerca de 45-60 segundos para remover alguns dos cabelos superfície externa do córion. Não enrole mais de embriões 07/05 de uma vez esta precaução irá minimizar o risco de esmagamento embriões um embaixo do outro. </li><li> Transferência de embriões limpo para um prato fresco de meio de embrião. </li></ol> 3. Fazer placas de agarose para a realização de embriões durante a microinjeção Embriões são mantidos em bebedouros durante a injeção feita com um molde de acrílico em agarose 1,5% (Figura 1). A concentração de agarose é importante para manter os embriões corretamente. <ol><li> Primeiro, faça um quadro de agarose para segurar o molde de acrílico. Despeje de agarose 1,5% em água a uma profundidade 0,5 cm em uma placa de Petri nove centímetros e espere até que ele se solidifica completamente. Cortar uma área da agarose apenas maior que o tamanho do molde. </li><li> Despeje de agarose 1,5% para preencher a área de corte e coloque o molde para que não haja bolhas e espere até que agarose solidifica. Esta placa de agarose podem ser armazenados na geladeira para acelerar solidifaction. </li><li> Remover o molde para criar calhas para segurar os ovos. Adicionar médio embrião o suficiente para mergulhar o molde, cubra e armazenar a 4 ° C até ser necessário. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquemática do molde feito sob medida usada para preparar as calhas em placas de agarose para microinjeção. </li></ol> 4. Microinjeção de embriões medaka Em medaka, DNA, RNA, oligonucleotides morfolino e corantes traçador são microinjeção através do córion para o citoplasma da 1-64 de células de embriões, em vez de estágio a gema como em zebrafish. Uma vez que o citoplasma é menor e menos visível na medaka, a prática pela injeção de corantes como rodamina-dextran é recomendado para desenvolver esta habilidade. Além do vermelho de fenol como traçador também é estimulada para permitir a confirmação das injeções. Como o córion torno embriões medaka é dura, um short, agulha de injeção forte e ampla é necessária (Figura 2). Prepare esta agulha de injeção forte de largura a partir de um filamento de vidro contendo-capilar. <ol><li> Preparar a solução de injeção com vermelho de fenol como traçador e carregá-lo para dentro da agulha na parte de trás com um microloader Eppendorf. Conecte a agulha para a bomba de ar do injetor. </li><li> Os ovos devem ser recolhidos e unclustered o mais rapidamente possível após a fertilização para injetar na fase de uma célula. Mais embriões podem ser injetadas, armazenando-os em gelo (não mais de 30 minutos) para interromper a divisão celular. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Comparação de agulhas e medaka zebrafish. Observe a ponta da agulha MF (em cima) é mais curto e mais largo, portanto, mais forte para a perfuração do córion dura em torno de embriões medaka. </li><li> Transferência de ovos na placa de agarose e alinhá-las nos bebedouros com uma pinça. Imediatamente antes da injecção, cinco ovos, devem ser mudados para que a membrana da célula do citoplasma de uma célula pode ser atingido por diaagulha e perpendicularmente. O citoplasma da célula de um pode ser encontrado por olhar para uma área desprovida de pequenas gotículas de óleo que fica em frente ao lado do ovo com gotas de óleo mais denso. A área identificada pode ser confirmado para ser o citoplasma através da visualização de lado. </li><li> Coloque a agulha para fechar os ovos. Abra a ponta da agulha suavemente tocar a ponta da agulha para o córion ou usando micropinças (Figura 3). Uma pequena quantidade de substância injecção deve ser visto a fluir para fora. </li><li> Punção através do córion para colocar a ponta da agulha no interior do córion. Ajuste a pressão de realização do injector a ser relativamente alto, para garantir que nenhum refluxo ocorre devido à alta pressão sobre punção através do córion resistente (configurações de 80-100hPA para exploração e pressão de 500 700hPa para a pressão de injeção). </li><li> Insira a ponta da agulha para o citoplasma acentuadamente por cutucando sua membrana. Evite inserir a ponta da agulha na gema. Ao contrário de peixe-zebra, material injetado na gema não será transferido para o citoplasma. Líquidos injetados tem um limite diferente quando injetado na gema enquanto que o limite é turva quando no citoplasma (Figura 4). Ocasionalmente, a agulha pode ficar bloqueado por agarose / detritos. Fórceps pode ser usado para tocar / quebrar novamente a ponta da agulha e remova o bloqueio. Se a agulha quebra em qualquer ponto durante a injeção, borbulhando será visto no meio de embrião e que a substância está a injectar será perdido. As injeções devem ser realizadas sistematicamente de cima para baixo ao longo dos canais agarose e da esquerda para a direita através do molde. </li><li> Embriões injetados devem ser transferidos para um prato limpo contendo meio de embrião e desenvolvido na temperatura adequada. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Quebrar a ponta da agulha antes da injeção. 1: Mova a ponta da agulha perto do córion do embrião; 2: Toque no córion e mover a agulha para trás e para frente com cuidado para quebrar ponta; 3: Quando uma pequena quantidade de substância de injeção flui para fora da extremidade da agulha isto confirma a quebra da ponta. </li></ol> 5. Resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Imagens representativas de embriões injetados medaka. Um painel mostra uma imagem representativa da injeção correta de rodamina-dextran no citoplasma de uma célula embrionária de um estágio medaka. Painel B mostra uma imagem representativa de injeção incorreta de rodamina-dextran no saco vitelino de uma célula do embrião estágio medaka. Painéis C e D mostram os embriões a partir de painéis A e B, respectivamente, cerca de 30 horas após a injecção. EM: embrião, anterior é para cima em painéis C e D e vista é dorsal. Observe o corpo do embrião no painel D não é vermelho como o corante foi incorretamente injetado no saco vitelino. Setas em B e D indicam rodamina-dextran injetado incorretamente no saco vitelino observe o limite distintos circular. Linhas pontilhadas em A e B indicam esboço do citoplasma de uma célula, visão é lateral.

<ol>
	<li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka,+Oryzias+latipes.">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li><li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+and+zebrafish,+an+evolutionary+twin+study.">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).</li></ol>

Neste vídeo, demonstramos um método para rastreamento de células, mRNA, ou DNA anti-senso de injeção de oligonucleotídeos em uma célula de embriões estágio medaka. Esta técnica permitiu-nos para estudar vários processos de desenvolvimento in vivo, em tempo real. Este processo e posterior análise detalhada que proporciona tem o potencial de aumentar significativamente a nossa compreensão da organogênese vertebrados e da biologia da célula subjacente. Tal conhecimento pode ser importante para, e rendimento de aplicações terapêuticas na medicina regenerativa.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4" fine net</td>
<td>Tools</td>
<td>J &amp; K Aquatics Ltd.</td>
<td>MD001</td>
<td>Used to capture fish during egg harvesting.</td>
</tr>
<tr>
<td>Embryo medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size </td>
<td>Tools</td>
<td>Hermes Abrasives Ltd.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>GC100-10F</td>
<td>For making microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige scientific instrument lab</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>For making microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf microloader</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>For loading microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Microinjector apparatus </td>
<td>Equipment</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model 5242.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model MN151.</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose injection plate</td>
<td>Tools</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For holding embryos during injection.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism

Neste vídeo, demonstramos a técnica da microinjeção em embriões de uma célula estágio medaka. Medaka é um pequeno peixe de água doce do egg-laying que permite que ambas as análises genéticas e embriológicas e é um dos organismos modelo de vertebrados em que genome-wide-driven fenótipo mutante telas foram realizadas 1, como no peixe-zebra eo mouse. Divergência de sobreposição funcional de genes relacionados entre medaka zebrafish e permite a identificação de fenótipos romance que não são identificáveis ​​em uma única espécie 2, assim medaka e peixe-zebra são complementares para análise genética de funções genoma dos vertebrados. Para aproveitar medaka peixes cujos embriões são transparentes e desenvolver externamente, microinjeção é uma técnica essencial para injetar células-traçadores para as células rotulagem, mRNAs ou sentido anti-oligonucleotides para o excesso de expressar e batendo-down genes de interesse, e para a tomada de DNAs linhagens transgênicas.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism at JoVE.com

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Medaka e peixe-zebra são complementares para análise genética de funções genoma dos vertebrados. Este protocolo destaca os pontos chave para a microinjeção de sucesso em embriões medaka, uma técnica importante para a análise embriológica e genética utilizando medaka zebrafish e em um laboratório.

Microinjeção de embriões Medaka para uso como um organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Research

JoVE Journal

Biology

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Vibrio cholerae: organismo modelo para estudar Patogênese Bacteriana - Entrevista

Biologia

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Uso de Rotorod como um método de análise qualitativa de Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...