Name: microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism
Uploaded: 2010-12-22T17:00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом MRC.

1. Спаривание и сбор яиц <ol><li> Женский и мужской оризии можно легко отличить по размеру и форме анального и спинного плавников. Анальный плавники самцы крупнее и параллелограмм формы по сравнению с самками. Женщины анальный плавник меньше, и треугольник форму. Мужской спинной плавник имеет четко видны глубокие выемки между двумя последними лучами. </li><li> Оризии откладывает до 40 яиц каждый день и оризии женщин нести яйца группируются в животе в результате наложения ареста нитей в течение нескольких часов, прежде чем они сняли на заводах в бак. </li><li> Женщины могут попасть в сеть и проведена внутри аккуратно с обеих сторон, одной рукой. Яйца могут быть затем мягко дразнили из живота с указательным пальцем другой руки. Женщина может быть затем возвращается в бак. Яйца должны быть переданы в 6 см чашку Петри заполнены эмбрион СМИ тупым пинцетом или пальцами. </li><li> Оризии пары редко бороться, когда они хранятся в небольшом окне спаривания. Таким образом, они могут храниться в одной небольшой бак с водой, чтобы они могли кормить и яйца могут быть собраны из той же паре каждый день в течение нескольких месяцев. </li><li> Важно, чтобы женщина рыба не должна быть без мужчины, поскольку овуляция происходит каждый день в оризии женщин. В противном случае, женщины не могут доставить яйца и стал себя плохо. </li></ol> 2. Очистка эмбрионов <ol><li> Передача вне кластера яйца с стеклянную пипетку, чтобы наждачную бумагу (P2000 зернистостью, водонепроницаемый), размещенные в крышке 9 см чашке Петри. Удалите излишки среде, но обеспечить достаточный объем остается, как предотвратить высыхание эмбрионов. </li><li> Аккуратно ролл эмбрионов на наждачную бумагу использовании указательного пальца, применяя минимальное давление и сохраняя палец параллельно поверхности наждачной бумагой около 45-60 секунд, чтобы удалить некоторые внешние волоски поверхности хориона. Не ролл более 5-7 эмбрионов одновременно эта мера предосторожности позволит свести к минимуму риск дробления эмбрионов под друг друга. </li><li> Передача очищены эмбрионов свежие блюда из эмбриона среды. </li></ol> 3. Создание агарозном пластины для проведения эмбрионов во время микроинъекции Эмбрионы находятся в желоба во время инъекции сделаны с плексигласа плесени в 1,5% агарозном (рис. 1). Концентрация агарозы важно провести эмбрионов должным образом. <ol><li> Во-первых, сделать рамку из агарозы провести плексигласа плесени. Залить 1,5% агарозы в воде до 0,5 см глубиной в 9 см чашку Петри и ждать, пока оно полностью затвердевает. Вырежьте области агарозном просто больше, чем размер формы. </li><li> Залить 1,5% агарозном заполнить сократить площадь и место пресс-формы, чтобы не быть пузырьков и ждать, пока агарозном затвердевает. Эта пластинка агарозы можно хранить в холодильнике, чтобы ускорить solidifaction. </li><li> Удалить плесень создать корыта, чтобы держать яйца. Добавьте достаточно средний эмбриона, чтобы погрузить форму, накрыть крышкой и хранить при 4 ° С до необходимости. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Схема заказные формы используются для подготовки желоба в виде пластин агарозы для микроинъекции. </li></ol> 4. Микроинъекция эмбрионов оризии В оризии, ДНК, РНК, олигонуклеотидов и морфолино трассирующими красители microinjected через хориона в цитоплазму с 1 по 64-клеточной стадии эмбриона, а не как в желтке рыбок данио. С цитоплазме меньше и менее заметны в оризии, практики путем введения красителей, таких как родамин-декстран рекомендуется развивать этот навык. Добавление фенол красный, как трассирующие также предлагается возможность подтвердить инъекций. Как хориона окружающих оризии эмбрионов жесткие, короткие, крепкие и широкие инъекционной иглой не требуется (рис. 2). Подготовка этого сильного широкий иглой с нитью содержащих стеклянный капилляр. <ol><li> Подготовка раствора для инъекций с фенолом красным, как трассирующие и загрузите его в иглу из спины с Эппендорф microloader. Подключите иглой воздушный насос инжектор. </li><li> Яйца должны быть собраны и вне кластера как можно скорее после оплодотворения вводить в один-клеточной стадии. Более эмбрионы могут быть введены, храня их на льду (не более 30 минут), чтобы остановить деление клеток. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Сравнение оризии и данио иглы. Обратите внимание на кончике иглы MF (вверху) короче и шире, следовательно, сильнее для прокалывания жесткие хориона окружающих оризии эмбрионов. </li><li> Передача яйца в пластину агарозы и приведения их в желоба щипцами. Незадолго до инъекции, пять яиц должна быть повернута так, клеточной мембране одной цитоплазме клеток может попасть йэлектронной иглу перпендикулярно. Цитоплазмы одной клетки может быть найден путем поиска области лишенной маленькие капельки масла, которое противоположно стороне яйца с плотной капель масла. Определены области может быть подтверждено, что цитоплазма при просмотре со стороны. </li><li> Место рядом с иглу яйца. Открытое кончике иглы, осторожно касаясь кончиком иглы хориона или с использованием microforceps (рис. 3). Небольшое количество инъекций вещества следует рассматривать вытекать. </li><li> Прокол через хориона поместить кончик иглы внутри хориона. Отрегулируйте проведения давление инжектора являются относительно высокими, чтобы убедиться в отсутствии рефлюкс возникает из-за высокого давления на прокол через жесткую хориона (настройки 80-100hPA для проведения давление и 500-700hPA для инъекций давления). </li><li> Вставьте кончик иглы в цитоплазме резким тыкая ее мембрану. Избегайте вставки кончике иглы в желтке. В отличие от данио рерио, материала вводят в желток не будет передана в цитоплазму. Введенный жидкости имеют четкой границы при введении в желтке в то время как граница размыта, когда в цитоплазме (рис. 4). Иногда игла может стать заблокирован агарозы / мусора. Пинцет может быть использован для сенсорного / повторно разбивать конце иглы и снять блокаду. Если игла перерывы в любой момент во время инъекции, пузырьков будет видно в эмбрион среднего и вещества вы инъекционных будут потеряны. Инъекции должны проводиться систематически сверху вниз по каналам агарозы и слева направо, по всей форме. </li><li> Введенный эмбрионы должны быть переданы в чистой блюдо с эмбрионом средних и разработаны при соответствующей температуре. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. Нарушение иглы перед инъекцией. 1: Перемещение кончик иглы близко к хориона эмбриона; 2: сенсорный хориона и перемещать иглу взад и вперед, мягко сломать кончик, 3: Когда небольшое количество инъекции вещество вытекает из конца иглы этой поломки подтверждает острия. </li></ol> 5. Представитель результаты <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig4.jpg" alt="Рисунок 4" /> Рисунок 4. Представителю изображения вводят эмбрионы оризии. Группа показывает, представитель образ правильной инъекции родамина-декстран в цитоплазме одноклеточного стадии эмбриона оризии. Группа B показывает, представитель образ неправильного введения родамин-декстран в желточный мешок из одноклеточных стадии эмбриона оризии. Панели C и D показывают эмбрионов из панелей А и В соответственно, примерно в 30 часов после инъекции. Е. М.: эмбрион, является передней панели вверх в С и D и зрения спинной. Обратите внимание, тело эмбриона в панели D не красный, как краситель был неправильно введен в желточного мешка. Стрелки B и D указывают родамин-декстран вводится неправильно в желточный мешок отметить отличие круговой границей. Пунктирные линии в А и В указывают контуры цитоплазмы одной клетки, представление боковых.

<ol>
	<li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka,+Oryzias+latipes.">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li><li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+and+zebrafish,+an+evolutionary+twin+study.">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).</li></ol>

В этом видео мы продемонстрируем метод для сотовых трассирующими, мРНК, ДНК или антисмысловой олигонуклеотид инъекции в одно-клеточной стадии эмбрионов оризии. Эта техника позволила нам изучать различные процессы развития в естественных условиях в режиме реального времени. Этот процесс и последующего детального анализа он предоставляет имеет потенциал, чтобы значительно расширить наше понимание позвоночных органогенеза и лежащий в основе клеточной биологии. Такие знания могут иметь важное значение для, и урожайность терапевтического применения в регенеративной медицине.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4" fine net</td>
<td>Tools</td>
<td>J &amp; K Aquatics Ltd.</td>
<td>MD001</td>
<td>Used to capture fish during egg harvesting.</td>
</tr>
<tr>
<td>Embryo medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size </td>
<td>Tools</td>
<td>Hermes Abrasives Ltd.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>GC100-10F</td>
<td>For making microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige scientific instrument lab</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>For making microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf microloader</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>For loading microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Microinjector apparatus </td>
<td>Equipment</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model 5242.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model MN151.</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose injection plate</td>
<td>Tools</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For holding embryos during injection.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism

В этом видео мы продемонстрируем техники микроинъекции в одно-клеточной стадии эмбрионов оризии. Оризии небольшой откладки яиц пресноводных рыб, что позволяет как генетические, так и эмбриологических анализы и является одной из позвоночных организмов модель, в которой генома фенотипа мутанта управляемых экранов проводились 1, как и данио рерио и мыши. Дивергенция функциональных перекрытия связанных генов между оризии и данио позволяет идентифицировать новые фенотипы, которые идентифицированы в один вид 2, таким образом оризии и данио являются взаимодополняющими для генетических вскрытия позвоночных функции генома. Для того чтобы воспользоваться оризии рыбы чьи эмбрионы являются прозрачными и развитие внешне, микроинъекции является важной техникой для введения клеточного индикаторов для маркировки клеток, мРНК или антисмысловые олигонуклеотиды более-выражения и стучать вниз гены интерес, и ДНК для создания трансгенных линий.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism at JoVE.com

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Оризии и данио являются взаимодополняющими для генетических вскрытия позвоночных функции генома. Этот протокол освещаются ключевые моменты для успешного микроинъекции в эмбрионы оризии, важная техника для эмбриологических и генетических анализа с использованием оризии и данио в лаборатории.

Микроинъекция эмбрионов оризии для использования в качестве модели Генетические организма

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Research

JoVE Journal

Biology

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Холерный вибрион: Модель Организм по изучению бактериальных Патогенез - Интервью

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Микроинъекция А. Эмбрионы aegypti получить Трансгенные комары

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Метод полного окрашивания антител горе в Чик

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Использование Rotorod как метод Качественный анализ Прогулка по Крыса

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Микроинъекция мРНК и Олигонуклеотиды морфолино антисмысловых в данио рерио эмбрионов.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Микроинъекции данио рерио Эмбрионы для анализа функции гена

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Генетические исследования белков человека Ремонт ДНК Использование дрожжей в качестве модельной системы

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Dechorionation эмбрионов оризии и клеточной трансплантации для генерации химерами

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...