Name: immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells using a self-made cytospin apparatus
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus at JoVE.com

<p class="jove_content"> Un financement partiel de ce travail a été fourni par NSF-CAREER 0744556 (Rao) et une bourse par le biais de l&#39;éducation VCU-HHMI Programme de sciences et de la recherche (Pascual). </p>

<p class="jove_title"> Partie 1: Coloration Suspension immunocytochimique </p><ol><li> Les cellules sont récoltées dans une suspension cellulaire unique. </li><li> Les cellules sont ensuite transférés dans des microtubes de 1,5 2mL et centrifugé à 200g pendant 4 minutes. </li><li> Les cellules sont lavées par l&#39;aspiration à surnageant, remis en suspension dans 1ml de PBS - (sans Mg <sup>2 +</sup> et Ca <sup>2 +)</sup> et ensuite centrifugé à nouveau à 200g pendant 4 minutes. Cela devrait être fait deux fois. </li><li> Après lav...

<ol>
	<li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells.">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> <em style='font-style: italic'>Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays</em>. <b>407</b>, 51-61 (2007).</li><li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homemade+cytospin+apparatus.">A homemade cytospin apparatus.</a> <em style='font-style: italic'>Anal. Biochem</em>. <b>359</b>, 283-284 (2006).</li></ol>

<p class="jove_content"> Aux fins de notre laboratoire, un plat de 35mm de cultures de cellules souches cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) est alloué pour la procédure de marquage immunocytochimique pour une utilisation avec l&#39;appareil cytospin. Les cellules sont ensuite collectées par le biais du enzymatique repiquage, en supprimant autant de la couche MEF que possible, en une suspension à cellule unique. Si plus une isolation efficace de cellules souches à partir de la couche MEF est souhaitée, les colonie...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lab Tek Permanox Chamber Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>117437</td>
<td>Material for re-used plastic slides</td>
</tr>
<tr>
<td>Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1-10&mu;L Filter Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1121-3810</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Cover Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>120542-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal 280</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Richard-Allan Scientific</td>
<td>8311-4</td>
<td>Mounting Medium</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10000C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4304</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4303</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11029</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11006</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI, Dihydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CalBioChem</td>
<td>268298</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells using a self-made cytospin apparatus

<p class="jove_content">Cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) qui incluent des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et humains cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs) sont des sources de cellules passionnante en raison de leur auto-renouvellement illimité des capacités et leur potentiel de se différencier en plusieurs types cellulaires. L&#39;état pluripotent des hPSCs est généralement évaluée par des techniques telles que qPCR, immunocytochimie, et par d&#39;autres<em&gt; In vitro</em&gt; Et<em&gt; In vivo</emLes stratégies de différenciation&gt; en plusieurs types cellulaires. Parmi ces derniers, des techniques immunocytochimiques ont été développés pour la caractérisation de routine de l&#39;état indifférencié de hPSCs basée sur l&#39;analyse des biomarqueurs candidats intracellulaire et la surface des cellules. Compte tenu du fait que grandir en tant hPSCs colonies, des problèmes surgissent dans la quantification de l&#39;expression de ces marqueurs au niveau des cellules individuelles sur une base routinière. Analyses par cytométrie en flux permettent d&#39;aborder cette question, mais nécessitent un nombre de cellules et l&#39;utilisation de réactifs qui ne sont normalement pas propice à l&#39;évaluation de la qualité de contrôle de routine des cultures HPSC. Ainsi, le développement de moyens pratiques et reproductibles de créer des échantillons de cellules monocouche avec intégrité préservée pour l&#39;évaluation marqueur a de nombreux avantages en matière de recherche sur les cellules souches. Cela profite grandement analyse immunocytochimique des cellules individuelles en raison de la monocouche peut être facilement observés et quantifiés pour l&#39;expression de marqueurs spécifiques. Pour atteindre cet objectif, un appareil de self-made cytospin a été construit et optimisé pour une utilisation avec la coloration immunocytochimique. Deux marqueurs de surface cellulaire (SSEA3/SSEA4) d&#39;expression ont été analysés dans une ligne de la variante BG01 cellules souches dans le but de ce protocole.</p>

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Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

<p class="jove_content">Suspension coloration immunocytochimique de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) pour les marqueurs de surface cellulaire (SSEA-3/SSEA-4) a été réalisé basée sur l&#39;utilisation d&#39;un appareil de self-made cytospin de créer une monocouche de cellules d&#39;observation et de quantification.</p>

Analyse immunocytochimique des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un appareil Self-Made Cytospin

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

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Génération de l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites à partir de sang périphérique en utilisant le vecteur lentiviral STEMCCA

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

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