Name: immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells using a self-made cytospin apparatus
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus at JoVE.com

<p class="jove_content"> Teilfinanzierung für diese Arbeit wurde von der NSF-CAREER 0744556 (Rao) und ein Stipendium durch die VCU-HHMI Science Education und Research Program (Pascual) zur Verfügung gestellt. </p>

<p class="jove_title"> Teil 1: Die Aussetzung immunzytochemische Färbung </p><ol><li> Die Zellen werden in einer einzigen Zellsuspension geerntet. </li><li> Die Zellen werden dann in 1,5-2ml Reaktionsgefäße überführt und zentrifugiert bei 200g für 4 Minuten. </li><li> Die Zellen werden durch Absaugen aus Überstand gewaschen, in 1 ml PBS resuspendiert - (ohne Mg <sup>2 +</sup> und Ca <sup>2 +)</sup> und dann wieder bei 200g für 4 Minuten zentrifugiert. Dies sollte zweimal durchgeführt werden. </li><li> Nach dem Waschen werden die Zellen...

<ol>
	<li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells.">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> <em style='font-style: italic'>Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays</em>. <b>407</b>, 51-61 (2007).</li><li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homemade+cytospin+apparatus.">A homemade cytospin apparatus.</a> <em style='font-style: italic'>Anal. Biochem</em>. <b>359</b>, 283-284 (2006).</li></ol>

<p class="jove_content"> Für die Zwecke unseres Labors, ist ein 35-mm-Schale von Stammzell-Kulturen auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) gewachsen für die immunzytochemische Färbung Verfahren für den Einsatz mit dem Zytospin Apparat zugeteilt. Die Zellen werden dann mit Hilfe von enzymatischen Passagieren gesammelt, die Beseitigung so viel von der MEF-Schicht wie möglich, in einen Ein-Zell-Suspension. Wenn effektiver Stammzellen isoliert von der MEF-Schicht gewünscht wird, kann Kolonien manuell kommissioniert dann verdaut in Suspensio...

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lab Tek Permanox Chamber Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>117437</td>
<td>Material for re-used plastic slides</td>
</tr>
<tr>
<td>Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1-10&mu;L Filter Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1121-3810</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Cover Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>120542-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal 280</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Richard-Allan Scientific</td>
<td>8311-4</td>
<td>Mounting Medium</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10000C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4304</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4303</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11029</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11006</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI, Dihydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CalBioChem</td>
<td>268298</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells using a self-made cytospin apparatus

<p class="jove_content">Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs), dass menschliche embryonale Stammzellen (hES) und der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) enthalten, werden spannende Zellquellen aufgrund ihrer grenzenlosen Selbst-Erneuerung Fähigkeiten und ihr Potenzial, in verschiedenen Zelltypen zu differenzieren. Die pluripotenten Zustand hPSCs ist in der Regel durch Techniken wie qPCR, Immunzytochemie beurteilt und von anderen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In vivo</em&gt; Differenzierung Strategien in verschiedenen Zelltypen. Unter diesen haben immunzytochemische Techniken zur Routine Charakterisierung der undifferenzierten Zustand der hPSCs auf der Analyse der Kandidat intra-und Zell-Oberflächen-Biomarkern entwickelt worden. Angesichts der Tatsache, dass hPSCs als Kolonien, Probleme bei der Quantifizierung der Expression dieser Marker an den einzelnen Zell-Ebene auf einer routinemäßigen entstehen wachsen. Durchflusszytometrie-Analysen dienen dazu, dieses Problem zu lösen, sondern bedürfen Zellzahlen und die Verwendung von Reagenzien, die normalerweise nicht förderlich für die routinemäßige Qualitätskontrolle Beurteilung HPSC Kulturen. So hat die Entwicklung von praktischen und reproduzierbare Mittel zur Schaffung von Monolayer Zellproben mit erhaltener Integrität für Marker Auswertung viele Vorteile in der Stammzellforschung. Diese großen Nutzen immunzytochemische Analyse, weil einzelne Zellen aus dem Monolayer leicht beobachtet werden können und quantifiziert für die Expression spezifischer Marker. Mit diesem Ziel wurde ein self-made Zytospin Apparat konstruiert und optimiert für den Einsatz mit immunzytochemische Färbung. Zwei Zelloberflächen-Marker (SSEA3/SSEA4) Expression wurden in einer Variante BG01 Stammzell-Linie für die Zwecke dieses Protokolls analysiert.</p>

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Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

<p class="jove_content">Suspension immunzytochemische Färbung von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) für Zell-Oberflächen-Marker (SSEA-3/SSEA-4) wurde basierend auf der Verwendung einer self-made Zytospin Apparat zu einer Monoschicht von Zellen für die Beobachtung und Quantifizierung erstellen erreicht.</p>

Immunzytochemische Analyse von menschlichen pluripotenten Stammzellen mit Hilfe eines Self-Made Cytospin Apparatus

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Analyse von pluripotenten Stammzellen mit Kryoschnitte von Embryoid Bodies

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Forschung

Biologie

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...