Name: immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells using a self-made cytospin apparatus
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus at JoVE.com

<p class="jove_content"> Finanziamento parziale per questo lavoro è stato fornito da NSF-CARRIERA 0744556 (Rao) e una borsa di studio attraverso il VCU-HHMI Scienze dell&#39;educazione e della Research Program (Pascual). </p>

<p class="jove_title"> Parte 1: Sospensione colorazione immunocitochimica </p><ol><li> Le cellule sono raccolte in una sospensione di cellule singole. </li><li> Le cellule sono poi trasferiti in 1,5-microcentrifuga da 2 ml tubi e centrifugati a 200g per 4 minuti. </li><li> Le cellule sono lavate aspirando fuori surnatante, risospesi in 1 ml di PBS - (senza Mg <sup>2 +</sup> e Ca <sup>2 +)</sup> e poi centrifugati nuovamente a 200g per 4 minuti. Questo dovrebbe essere fatto due volte. </li><li> Dopo il lavaggio, le cellule vengono poi fissati da...

<ol>
	<li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells.">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> <em style='font-style: italic'>Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays</em>. <b>407</b>, 51-61 (2007).</li><li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homemade+cytospin+apparatus.">A homemade cytospin apparatus.</a> <em style='font-style: italic'>Anal. Biochem</em>. <b>359</b>, 283-284 (2006).</li></ol>

<p class="jove_content"> Ai fini del nostro laboratorio, un piatto di 35 mm di colture di cellule staminali coltivate su fibroblasti embrionali del mouse (MEF) è assegnato per la procedura di colorazione immunocitochimica per l&#39;utilizzo con l&#39;apparecchio cytospin. Le cellule sono poi raccolti tramite enzimatica passaging, eliminando quanto più dello strato MEF possibile, in una cella singola sospensione. Se è più efficace isolamento delle cellule staminali dallo strato MEF si desidera, le colonie possono essere raccolte manualmente ...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lab Tek Permanox Chamber Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>117437</td>
<td>Material for re-used plastic slides</td>
</tr>
<tr>
<td>Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1-10&mu;L Filter Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1121-3810</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Cover Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>120542-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal 280</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Richard-Allan Scientific</td>
<td>8311-4</td>
<td>Mounting Medium</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10000C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4304</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4303</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11029</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11006</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI, Dihydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CalBioChem</td>
<td>268298</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells using a self-made cytospin apparatus

<p class="jove_content">Cellule staminali pluripotenti (hPSCs) che includono cellule staminali embrionali umane (hESC) e umani cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) sono fonti di cellule eccitante a causa della loro illimitata capacità di auto-rinnovamento e il loro potenziale di differenziarsi in tipi cellulari diversi. Lo stato pluripotente di hPSCs è tipicamente valutata mediante tecniche come qPCR, immunocitochimica, e da altri<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em&gt; Strategie di differenziazione in tipi di cellule diverse. Tra questi, tecniche immunocitochimiche sono state sviluppate per la caratterizzazione di routine dello stato indifferenziato di hPSCs sulla base di analisi di biomarcatori candidato intracellulare e superficie cellulare. Dato il fatto che hPSCs crescere come colonie, i problemi sorgono nel quantificare l&#39;espressione di questi marcatori a livello cellulare individuali su base di routine. Analisi di citometria a flusso servire per risolvere questo problema, ma richiedono numero di cellule e l&#39;utilizzo di reagenti che non sono normalmente favorevole per la valutazione di routine di controllo di qualità di colture hPSC. Così, lo sviluppo di mezzi pratici e riproducibile di creare campioni di cellule monostrato con integrità preservata per la valutazione marcatore ha molti vantaggi nel campo della ricerca sulle cellule staminali. Questo benefici notevolmente l&#39;analisi immunocitochimica perché le cellule individuali dal monostrato può essere facilmente osservato e quantificato per l&#39;espressione di marcatori specifici. Verso questo obiettivo, un self-made cytospin apparato è stato costruito e ottimizzato per l&#39;utilizzo con colorazione immunocitochimica. Due marcatori di superficie cellulare (SSEA3/SSEA4) espressione sono stati analizzati in una linea di cellule staminali variante BG01 ai fini di questo protocollo.</p>

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Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

<p class="jove_content">Sospensione colorazione immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) per la superficie cellulare marcatori (SSEA-3/SSEA-4) è stato raggiunto sulla base di utilizzo di un self-made apparato cytospin per creare un monostrato di cellule per l&#39;osservazione e la quantificazione.</p>

Analisi immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti usando un Self-Made Apparato Cytospin

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

Research

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Biology

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Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

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Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

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Generazione di cellule pluripotenti indotte umane staminali da sangue periferico mediante il STEMCCA lentivirale Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

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Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre

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